Eliminación mecánica de coriones y membranas vitelinas: un método para preparar ovocitos de Drosophila para la observación directa

Este protocolo es un extracto de Perkins y Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. Eliminación de coriones y membranas vitelinas.

NOTA: Consulte Figura 1 para conocer las herramientas necesarias.

1. Ovocitos separados en etapa tardía
   1. Agregue 1 mL de PBSBTx a un plato de disección poco profundo. Use un P200 con una punta recubierta de BSA para transferir los ovarios fijos (en ~ 150 μL) a la placa poco profunda. Pipetee los ovarios hacia arriba y hacia abajo con la punta de pipeta recubierta de BSA para desalojar los ovocitos maduros de los ovocitos menos maduros.
   2. Cuando los ovocitos en etapa tardía estén suficientemente separados, transfiera todo el tejido a un tubo de microfuga de 500 μL. Retire el exceso de líquido con una pipeta Pasteur tirada, dejando unos 150 - 200 μL en el tubo. Repita la sección 1.1 para los genotipos restantes.
2. Prepárate para rodar
   1. Humedecer previamente un plato hondo con 200 μL de PBSBTx. Tapar y reservar. Obtenga 3 portaobjetos de vidrio esmerilado y deje el portaobjetos #3 a un lado. Frote suavemente las regiones de vidrio esmerilado de las diapositivas # 1 y # 2 juntas. Enjuáguelos con agua desionizada para eliminar los fragmentos de vidrio y séquelos con una toallita desechable.
   2. Cubra las regiones esmeriladas de los portaobjetos #1 y #2 con PBSBTx añadiendo 50 μL de PBSBTx a un portaobjetos y frotando esta región con el otro portaobjetos. Retire el líquido con una toallita desechable.
   3. Coloque los portaobjetos bajo un microscopio de disección en la configuración que se muestra en Figura 2A. Mantenga las regiones esmeriladas de los portaobjetos #1 y #2 en contacto, con el portaobjetos #3 soportando el portaobjetos #2.
3. Enrollar los ovocitos; asegúrese de que la dirección de rodar sea siempre en línea recta y nunca en un movimiento circular.
   1. Humedece previamente una punta de pipeta P200 en PBSBTx y dispersa los ovocitos en el tubo de microfuga pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera 50 μL de líquido que contiene ovocitos al centro de la parte de vidrio esmerilado de la diapositiva # 1. Levante la corredera # 2 para hacer esto.
   2. Baje lentamente la corredera # 2 hasta que la tensión superficial del líquido cree un sello entre las dos regiones de vidrio esmerilado. Debe haber suficiente líquido para cubrir el área helada, pero no debe filtrarse nada. Si el líquido se desborda, utilice una pipeta Pasteur tirada para eliminar el exceso de líquido.
   3. Sostenga la corredera inferior (#1) en su lugar con una mano y use la otra mano para mover la corredera superior (#2) hacia adelante y hacia atrás en una dirección horizontal, manteniendo la corredera # 2 nivelada y apoyada en la diapositiva # 3. Realizar bajo un microscopio para una fácil visualización de los movimientos y el progreso de los ovocitos.
      NOTA: Este movimiento generará fricción y hará que los ovocitos "rueden" y pierdan sus coriones. Se debe utilizar una presión mínima y los movimientos deben ser cortos y rápidos.
   4. Después de algunos movimientos en la dirección horizontal, cambie ligeramente el ángulo de movimiento (Figura 2B). En incrementos múltiples, aumente gradualmente este ángulo a 90° hasta que el movimiento de la corredera superior sea perpendicular a la dirección inicial (Figura 2B). Tenga en cuenta que los coriones vacíos serán visibles en el líquido y los ovocitos que carecen de coriones aparecerán más largos y delgados.
   5. Repita los pasos 1.3.3 - 1.3.4 aproximadamente de 7 a 10 veces hasta que la solución se vuelva ligeramente turbia. Dejar de rodar cuando la mayoría de los ovocitos (75 - 85%) parecen haber perdido sus membranas vitelinas.
      NOTA: Un extremo puntiagudo distintivo es a menudo visible en los ovocitos que carecen de membranas vitelinas. Las membranas vitelina son más difíciles de eliminar que los coriones. Se puede aplicar una ligera presión a la corredera superior (corredera # 2) mientras se rueda para lograr la eliminación de las membranas vitelinas. Tratar de eliminar las membranas vitelina de todos los ovocitos a menudo resulta en la destrucción de otros ovocitos.
   6. Levante suavemente el portaobjetos superior (#2), arrastrando una de sus esquinas hasta el centro de la región esmerilada del portaobjetos inferior (#1) para que los ovocitos enrollados se acumulen en el centro de la región escarchada. Enjuague los ovocitos de ambos portaobjetos con PBSBTx en el plato de pocillos profundos que contiene PBSBTx.
   7. Limpie los portaobjetos # 1 y # 2 con agua ultrapura, séquelos con una toallita desechable y reinicie. Repita los pasos 1.3.1 a 1.3.6 hasta que todos los ovocitos del mismo genotipo hayan rodado. Por lo general, esto requiere de 3 a 4 rondas de laminación por genotipo.
4. Retire los escombros después de rodar
   1. Agregue 1 mL de PBSBTx a un tubo cónico de 15 mL. Agita el líquido para cubrir los lados del tubo.
   2. Con una punta de pipeta P1000 recubierta de PBSBTx, transfiera los ovocitos enrollados de la placa de pocillos profunda al tubo cónico que contiene 1 mL de PBSBTx. Agregue 2 mL adicionales de PBSBTx al tubo cónico que contiene los ovocitos.
   3. Deje que los ovocitos comiencen a asentarse en el fondo, luego retire los 2 ml superiores de la solución que contiene desechos (coriones, vitelinas, etc.) con un P1000 y deséchelo. Si es necesario, sostenga el tubo cónico sobre un fondo oscuro para ver los ovocitos opacos a medida que se hunden.
   4. Añada 2 ml adicionales de PBSBTx a los ovocitos y repita el paso 1.4.3. Repita 1.4.3. para un total de 3 rondas de remoción de escombros.
   5. Con una punta de pipeta P1000 recubierta de PBSBTx, transfiera los ovocitos al tubo de microfuga original de 500 μL. De 20 a 25 hembras deben producir aproximadamente 50 μL de ovocitos maduros enrollados.
5. Repita la sección 4 para los genotipos restantes usando portaobjetos frescos glaseados, un plato limpio y profundo y un tubo cónico nuevo para cada genotipo.
6. Si es necesario el almacenamiento, transfiera los ovocitos a 1x PBS con TritionX-100 al 0,1% y almacene durante la noche a 4 °C. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo porque la reticulación del formaldehído puede revertirse con detergentes no iónicos.

Figura 1: Herramientas de citología. Herramientas utilizadas en el protocolo: (1) par de pinzas (#5 Dumont); (2) aguja de tungsteno; (3) plato de pozo hondo con tapa; (4) plato de disección de vidrio poco profundo; (5) pipeta Pasteur tirada. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Disposición y movimiento de los portaobjetos para ovocitos rodantes. (A) Diagrama de la disposición del portaobjetos para la rodadura de ovocitos tal como se describe en el protocolo. El área más oscura denota la parte de vidrio esmerilado de la diapositiva. (B) Dirección de los vectores de movimiento de la diapositiva #2 durante el rodado de los ovocitos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.