Disrupción de la cutícula: un método para recolectar hemolinfa de larvas de Drosophila

Resumen

Fuente: Reimels, T. A. y Pfleger, C. M. Métodos para examinar la glándula linfática y los hemocitos en larvas de Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

La hemolinfa de Drosophila sirve como sangre y líquido intersticial, circulando por todo el cuerpo durante las etapas de larva y adulto. En este vídeo se describe un protocolo de recogida de hemolinfa larvaria con el fin de cuantificar las células circulantes.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Reimels y Pfleger, Métodos para examinar la glándula linfática y los hemocitos en larvas de Drosophila, J. Vis. Exp.(2016).

1. Concentración de hemocitos circulantes

1. Para obtener larvas de aproximadamente la misma etapa de desarrollo para este ensayo, restrinja la recolección de huevos permitiendo que las hembras pongan huevos durante un período de tiempo fijo de 2 a 6 horas.
2. Recoja las larvas en pozos de placa de disección llenos de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x.
3. Para cada larva, coloque 10 μl 1x PBS en un tubo de microcentrífuga sobre hielo y 10 μl 1x PBS en una almohadilla de disección limpia. Coloque la almohadilla de disección sobre una base de microscopio estereoscópico iluminada.
4. Seque una larva individual colocándola en una toallita de papel antes de transferirla a una gota de PBS en la almohadilla de disección.
5. Con un par de pinzas, abra suavemente e invierta con cuidado la cutícula para liberar la hemolinfa.
   NOTA: Tenga cuidado de no raspar o pinchar la cutícula, ya que esto podría liberar hemocitos sésiles.
6. Con una pipeta, recoja la hemolinfa de la almohadilla de disección. Evite recolectar restos de larvas como el cuerpo graso.
7. Agregue la hemolinfa a un tubo de microcentrífuga y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: Se pueden recolectar varias muestras a la vez y mantenerlas en hielo hasta por una hora.
8. Opcional: Mezclar azul de tripano con la muestra de hemolinfa a partes iguales para teñir y excluir las células muertas. Cuente las células dentro de los 3 minutos posteriores a la adición de azul de tripán porque es tóxico para las células.
9. Mezcle la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de cargar 10 μl en una cámara de hemocitómetro.
10. Si utiliza un contador de celdas automatizado, establezca los parámetros adecuados para el tamaño de celda y la circularidad. Por ejemplo, establezca un tamaño de celda mínimo de 2 μm, un tamaño de celda máximo de 22 μm y una circularidad de 75 a 80% de redondez para detectar hemocitos redondos normales. Experimente con diferentes parámetros para detectar hemocitos más grandes y fusiformes, como los laminocitos. Alternativamente, use un hemocitómetro para contar los hemocitos manualmente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tabletas PBS	MP Biomedicals	2810305
plato de disección	Corning	7220-85
tubo de microcentrífuga	Denville	C2170
Almohadilla de disección de silicona, fabricada con el kit Sylgard 184	Krayden (distribuido a través de Fisher)	NC9644388 (número de catálogo de Fisher)	Fabricado en placa de Petri mezclando los componentes del kit de elastómero Sylgard de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Microscopio estereoscópico	Morrell Instruments (distribuidor de Nikon)	MNA42000, MMA36300	Modelos Nikon SMZ1000 y SMZ645
toallita de pañuelo	VWR	82003-820
fórceps	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72700-DZ
Pipeta P200	Eppendorf	3120000054
Contador de celdas automatizado Countess	Invitrogen	C10227
Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess	Invitrogen	C10283
hemocitómetro	Hausser Científico	3200
Tinción azul de tripano	Tecnologías de la Vida	T10282