Disección del complejo ojo-cerebro de pupas de mosca: un método para aislar el tejido de la retina

Abstract

Fuente: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Disección de la retina de la pupa de Drosophila para inmunohistoquímica, análisis occidental y aislamiento de ARN. J. Vis. Exp.(2019).

Este video describe cómo diseccionar y aislar el complejo ojo-cerebro de las pupas de Drosophila. El protocolo presentado demuestra que el procedimiento produce tejido de alta calidad, compatible con, por ejemplo, la inmunotinción, así como otros experimentos de expresión génica.

Protocol

Este protocolo es un extracto de DeAngelis and Johnson, Disection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp.(2019).

1. Preparación de tejidos

1. Establezca cruces de Drosophila (como se describió anteriormente en Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) o cepas de Drosophila específicas para obtener pupas del genotipo deseado. Para asegurarse de que un gran número de pupas emerjan coincidentemente, establezca estos cultivos de moscas por duplicado en medios alimenticios ricos en nutrientes o medios alimenticios estándar generosamente complementados con pasta de levadura.
2. Mantener los cultivos de Drosophila a 25 °C. Para los cruzamientos que utilizan el sistema UAS-GAL4, GMR-GAL4 es un impulsor ideal que se expresa en las células del disco ocular de las larvas posteriores al surco morfogenético y durante todo el desarrollo de la pupa. El cruce UAS-lacZ X GMR-GAL4 sirve como un cruce de control ideal, ya que impulsa la expresión de la proteína β-galactosidasa no endógena e inerte.
3. Use la punta de una férula de bambú de 6" que se haya humedecido con agua destilada para levantar suavemente las pre-pupas blancas (Figura 1B) del costado de los viales de cultivo saludables (Figura 1A) y colóquelas en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL (Figura 1C).
4. Coloque los tubos en una caja de punta de pipeta de plástico junto con un pequeño trozo de pañuelo empapado en agua destilada para mantener la cámara con suficiente humedad para proteger las pupas de la desecación (Figura 1D). Incubar las pupas a 25 °C hasta la disección.
5. Use una férula de bambú seca de 6" para empujar suavemente las pupas fuera del tubo de microcentrífuga y colocarlas en un plato de disección negro. Coloque un pedazo nuevo de cinta adhesiva de doble cara en el plato de disección, lejos de las pupas.
6. Con un par de pinzas, coloque con cuidado las pupas con el lado dorsal hacia arriba (es decir, con los opérculos hacia arriba, Figura 1B) sobre la cinta (Figura 2A). Asegúrese de que las pupas se adhieran bien a la cinta.
   NOTA: La humedad en la carcasa de la pupa inhibirá la adhesión segura a la cinta, en cuyo caso, permita que las pupas se sequen al aire antes de colocarlas en la cinta de doble cara.

2. Disección de los complejos ojo-cerebro

1. Utilice fórceps para extraer el opérculo de cada pupa (Figura 2C).
2. Use tijeras de microdisección para cortar o rebanar la caja de la pupa de cada pupa. Abra la caja de la pupa para revelar la cabeza, el tórax y el segmento abdominal anterior, asegurando los bordes de la caja de la pupa a la cinta de doble cara (Figura 2C).
   NOTA: No es necesario revelar por completo las pupas.
3. Perfore el abdomen de cada pupa con pinzas afiladas, para agarrar al animal, y retírelo de su estuche de pupa (Figura 2C).
4. Coloque las pupas en el plato de disección negro, lejos de la cinta, y cúbralas con aproximadamente 400 μL de solución tamponada con fosfato helada (PBS, pH 7.4).
5. Agarre cada pupa por el abdomen con pinzas y, con unas tijeras de microdisección, haga un corte transversal limpio a través de todo el tórax, cortando la pupa por la mitad (Figura 2D).
6. Retire el remanente posterior de cada canal del PBS y colóquelo a un lado en el plato de disección (no lo deseche, consulte el paso 3.2.1).
7. Usando dos pares de pinzas finas, abra el tórax y la cabeza de cada pupa para revelar el complejo ojo-cerebro (Figura 2E). Para hacer esto, agarre los bordes cortados del epitelio del tórax y desgarre gradualmente para abrir el tórax y luego la cápsula de la cabeza, exponiendo el complejo ojo-cerebro y el tejido graso circundante.
8. Sin agarrar el tejido, use fórceps para guiar el complejo ojo-cerebro lejos de los restos de la cápsula de la cabeza o saque el complejo ojo-cerebro de la cápsula de la cabeza desgarrada><. NOTA: El complejo ojo-cerebro tiene forma de mancuerna, de color blanquecino y es más translúcido que la grasa circundante de color crema (Figura 2B,E).
9. Con pinzas, retire cuidadosamente la mayor parte de la grasa asociada con los complejos ojo-cerebro sin tocar el tejido ocular.

3. Procesamiento de tejido para inmunofluorescencia

1. Diseccione al menos 6-10 pupas como se describe (pasos 2.1-2.9).
   NOTA: Tres o cuatro réplicas independientes de cada disección tienden a proporcionar datos suficientes para probar una hipótesis.
2. Lavado y fijación
   1. Corte la punta de una pipeta P20 o P100 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la abertura de la punta a ~1 mm de radio y lubrique pipeteando una mezcla de PBS y grasa hacia arriba y hacia abajo. Esta grasa se puede obtener de los restos de la canal eliminados en el paso 2.6.
   2. Transfiera los complejos ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBS en un plato de vidrio de 9 pocillos, con hielo. Utilice la punta lubricada y una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 para transferir.
      NOTA: Los complejos ojo-cerebro se adherirán a las puntas no lubricadas durante el pipeteo y se dañarán o perderán.
   3. Elimine la grasa restante asociada con el tejido ocular pipeteando el PBS hacia arriba y hacia abajo para agitar suavemente los complejos ojo-cerebro. En este y en todos los pasos de lavado posteriores, no pipetee directamente los complejos ojo-cerebro hacia arriba y hacia abajo, ya que esto dañará el frágil tejido ocular.
   4. Transfiera los complejos ojo-cerebro en un volumen mínimo (<20 μL) de PBS a al menos 250 μL de fijador. Mezcle pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 35 min, en hielo.
      NOTA: Para esta transferencia se puede utilizar la misma punta lubricada preparada en el paso 3.1.1.
   5. Con la misma punta de pipeta, transfiera los complejos ojo-cerebro a un pocillo que contenga ~400 μL de PBS. Mezclar pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5-10 min en hielo, para lavar. Repita el paso de lavado al menos dos veces.
      NOTA: Los complejos ojo-cerebro pueden mantenerse durante varias horas en el lavado final de PBS, en hielo, o a 4 °C, antes de continuar con el paso 3.3.1.
3. Tinción de anticuerpos
   1. Para bloquear el tejido antes de la exposición a las soluciones de anticuerpos, transfiera los complejos ojo-cerebro a ~400 μL de PBT. Utilice la punta lubricada y una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 para la transferencia. Incubar durante 10 a 60 min, en hielo.
   2. Prepare la solución de anticuerpos primarios diluyendo los anticuerpos apropiados en PBT. Dado que los complejos ojo-cerebro se incuban en alícuotas de 10 μL de solución de anticuerpos, el volumen preparado será una réplica de 10.
   3. Alícuota 10 μL de solución de anticuerpos en un pocillo limpio de una bandeja de micropocillos de 72 pocillos.
   4. Corte la punta de una pipeta P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la abertura de la punta a ~0,5 mm de radio y lubrique pipeteando PBT hacia arriba y hacia abajo.
   5. Transfiera no más de 5 complejos ojo-cerebro, en un volumen de <3 μL de PBS, a cada pocillo de 10 μL de solución de anticuerpos utilizando una micropipeta de desplazamiento de aire P10 y la punta lubricada.
   6. Homogeneice la solución de anticuerpos pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. No pipetee los complejos ojo-cerebro hacia arriba y hacia abajo, ya que esto dañará el tejido.
   7. Para minimizar la evaporación de la solución de anticuerpos, coloque un pequeño trozo de tejido empapado en agua destilada en la bandeja de micropocillos y selle la bandeja (por ejemplo, con la tapa provista). Incubar durante la noche a 4 °C.
   8. Transfiera los complejos ojo-cerebro de la bandeja de micropocillos a ~ 400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pocillos, para lavar. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P10 y una punta lubricada con PBT (prepárela como se describe en el paso 3.3.4). Mezcle pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 min en hielo.
   9. Repita el paso de lavado al menos dos veces. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir los complejos ojo-cerebro entre las soluciones de lavado.
   10. Prepare la solución de anticuerpos secundarios diluyendo los anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos apropiados en PBT, según sea necesario. 100 μL de solución de anticuerpos secundarios son suficientes por lote de 6-10 pupas. Alicuente la solución de anticuerpo secundario en una placa de disección de vidrio de 9 pocillos.
   11. Transfiere los complejos ojo-cerebro a una solución secundaria de anticuerpos. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para la transferencia.
   12. Incubar los complejos ojo-cerebro en una solución secundaria de anticuerpos durante 1-2 h a temperatura ambiente, o 3-5 h a 4 °C. Para evitar el blanqueo de los fluoróforos por la luz, cubra la preparación con papel de aluminio.
       NOTA: La duración óptima de la incubación en la solución de anticuerpos secundarios puede diferir según los anticuerpos primarios y secundarios utilizados.
   13. Transfiera los complejos ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pocillos, para lavar. Mezcle pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 min en hielo. Este paso de lavado debe repetirse al menos dos veces.
4. Fijación secundaria
   1. Para una fijación secundaria, transfiera los complejos ojo-cerebro a por lo menos 200 μL de fijador e incube durante 20 min a temperatura ambiente o 35 min a 4 °C.
      NOTA: La fijación secundaria endurece el tejido ocular, lo que ayuda al montaje (paso 3.5).
   2. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir los complejos ojo-cerebro a ~400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pocillos, con hielo, para lavar durante 5 minutos.
   3. Repita el paso de lavado al menos una vez.
   4. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir los complejos ojo-cerebro a ~400 μL de PBS en un plato de vidrio de 9 pocillos, con hielo, para enjuagar durante 1-2 min. Mantenga el tejido en movimiento pipeteando PBS, pero no el tejido, hacia arriba y hacia abajo para evitar que los complejos ojo-cerebro se asienten y se adhieran al plato de vidrio durante el enjuague de PBS.
5. montura
   1. Transfiera los complejos ojo-cerebro a ~ 200 μL de medios de montaje. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y una punta lubricada con PBT para transferir los complejos ojo-cerebro. Deje que el tejido se equilibre en el medio de montaje durante 1-2 h.
   2. Coloque una gota de 5-8 μL de medio de montaje nuevo en un portaobjetos de microscopio limpio.
   3. Corte una punta P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la apertura de la punta a ~0,5 mm de radio y utilice esta y una micropipeta de desplazamiento de aire P10 para transferir los complejos ojo-cerebro en 5-8 μL de medios de montaje a la gota de medios de montaje en el portaobjetos.
   4. Use dos agujas de tungsteno para separar los ojos de los lóbulos ópticos. Sujete un complejo ojo-cerebro al portaobjetos con una aguja de tungsteno resistente y corte cada ojo de su lóbulo óptico asociado con una aguja fina de tungsteno (Figura 2F).
   5. Utilice la aguja fina de tungsteno para maniobrar cada ojo hacia la superficie del portaobjetos del microscopio con la superficie basal de cada ojo adyacente al portaobjetos. Baje suavemente un cubreobjetos limpio sobre el pañuelo y asegúrelo con esmalte de uñas.
      NOTA: Organizar los ojos en el portaobjetos de manera que estén cerca unos de otros o en línea facilitará la microscopía posterior.
   6. Obtener imágenes de las retinas mediante microscopía fluorescente o confocal.
      NOTA: Los portaobjetos deben almacenarse a 4 °C si no se toman imágenes inmediatamente.

Results

Figura 1: Selección y cultivo de pupas para disección. (A) Las larvas y pupas del tercer estadio larvario (L3) errantes se ubican a lo largo de los lados de los cultivos sanos de Drosophila. (B) Las pre-pupas se pueden identificar por su color blanco translúcido, ya que aún no se ha generado pigmento en la caja protectora de la pupa. El eje antero-posterior y dorso-ventral de la...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Férulas de bambú, 6"	Ted Pella Inc	Artículo 116
Plato de disección negro			Placa de Petri de vidrio llena hasta el borde con SYLG170 o SYLG184 (de color negro con polvo de carbón finamente molido). Dejar a temperatura ambiente durante 24-48 h para polimerizar.
Portacuchillas	Herramientas de Bellas Ciencias	10053
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A7906
Cinta adhesiva de doble cara	3M	665
Drosophila y medios alimentarios, ricos en nutrientes			7,5% sacarosa, 15% glucosa, 2,5% agar, 20% levadura de cerveza, 5% peptona, 0,125% MgSO4.7H2O, 0,125% CaCl2.2H20
Drosophila y medios alimentarios, estándar			Receta de harina de maíz del centro Bloomington Drosophila Stock. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Solución fijadora			4% de formadehído en PBS, pH 7,4.
fórceps	Herramientas de Bellas Ciencias	91150-20	Las pinzas deben afilarse con frecuencia.
Formaldehído	Termo Científico	28908
Platos de vidrio de 9 pocillos	Corning	7220-85	También conocido como platos de 9 pocillos
Cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm)	Fisher Científico	12-542-B
Portaobjetos de microscopio de vidrio (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Científico	12-550-413
Placa de Petri de vidrio	Corning	3160-100BO
glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Tubos de microcentrífuga	Axygen	MCT-175-C
Tijeras de microdisección	Herramientas de Bellas Ciencias	15000-03
Bandejas de micropocillos (72 pocillos de 10 μL)	Nunc	438733
Medios de montaje			0,5% de N-propilgalato y 80% de glicerol en PBS
N-propilgalato	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Pbt			0,15% de TritonX y 0,5% de albúmina sérica bovina en PBS, pH 7,4
Soporte de alfileres	Herramientas de Bellas Ciencias	26016-12
Anticuerpo primario: anti-GAPDH de cabra	Imgenex	IMG-3073	Para Western blotting. Usado a 1:3000
Anticuerpo primario: Dcp-1 anti-escisión de conejo	Señalización celular	9578S	Para inmunofluorescencia. Usado a 1:100
Anticuerpo primario: rata anti-DEcad	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	DCAD2	Para inmunofluorescencia. Usado en 1:20
Anticuerpo primario: rata anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Regalo de Tadashi Uemura. Se utiliza a escala 1:100.
Hojas de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias	10050	Rompa un pequeño trozo de hoja de escapala y asegúrelo en el soporte de la hoja.
Anticuerpo secundario: 488-conjugado burro anti-rata IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	Para inmunofluorescencia. Usado a 1:200
Anticuerpo secundario: IgG anti-conejo de cabra conjugada con cy3 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Números 111-165-144	Para inmunofluorescencia. Usado a 1:100
Anticuerpo secundario: IgG (H+L) anti-rata de cabra conjugada con HRP	Tecnología de señalización celular	7077	Para Western blotting. Usado a 1:3000
Anticuerpo secundario: IgG (H+L) anticabra de conejo conjugada con HRP	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	Para Western blotting. Usado a 1:3000
Microscopio estereoscópico de disección (M60 o M80)	Microsistemas Leica		o microscopio similar
Sylgard (negro)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparente)	Dow Corning	SYLG184	Color negro con polvo de charcol finamente molido
Pañuelo: toallitas Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Aguja de tungsteno, fina	Herramientas de Bellas Ciencias	10130-10	Insértelo en el soporte del pasador
Aguja de tungsteno, robusta	Herramientas de Bellas Ciencias	10130-20	Insértelo en el soporte del pasador
Pasta de levadura	(supermercado local)		Aproximadamente 2 cucharadas de levadura ActiveDry de Fleischmann (o similar) disueltas en ~20 mL de H2O destilado