Drosophila Disección del músculo de vuelo indirecto (IFM) de la pupa tardía: un método para la recolección de tejido de alto rendimiento

Resumen

Fuente: Kao, S. Y., et al. Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para aproximaciones ómicas. J. Vis. Exp. (2019).

Los músculos de vuelo de Drosophila se utilizan como sistema modelo para el desarrollo muscular y la fisiología. Este video describe la musculatura de vuelo de los adultos y destaca un protocolo para diseccionar músculos de vuelo indirecto en desarrollo que son adecuados para la secuenciación de ARN de pupas.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscle for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Disección IFM después de 48 h APF

1. Reúna el equipo necesario, incluyendo dos pinzas de grado biológico #5, tijeras finas, portaobjetos de microscopio de vidrio estándar, cinta adhesiva de doble adherencia, pipeta, puntas de pipeta, hielo seco y (para aplicaciones de ARN) reactivo de aislamiento (consulte la Tabla de materiales). Enfríe los tubos de 1x PBS y microcentrífuga en hielo.
2. Con un pincel ligeramente humedecido, transfiera las pupas escenificadas a una tira de cinta adhesiva de doble cara montada en un portaobjetos de microscopio (Figura 1A). Coloque las pupas en línea, orientadas en la misma orientación (ventral hacia abajo y anterior hacia la parte inferior del portaobjetos).
   NOTA: Ten cuidado de no usar demasiada agua en el pincel o el filtro, o las pupas no se pegarán bien. Si las pupas no se pegan, séquelas transfiriéndolas primero a un filtro seco o papel de seda. Monte tantas pupas como se puedan diseccionar dentro de una ventana de tiempo de 30 minutos, idealmente ~ 10 pupas.
3. Retira la pupa de la caja de pupa. Utilice fórceps para separar y abrir la caja de pupa por encima de los espiráculos anteriores (Figura 1B).
4. Deslice suavemente un par de pinzas dorsalmente hacia la parte posterior, cortando la caja de la pupa a medida que las pinzas se mueven (Figura 1B'). Ten cuidado de no romper la pupa subyacente. Libere la pupa de la caja abierta y transfiérala inmediatamente a una gota de 1x PBS en un segundo portaobjetos de microscopio (Figura 1B",C).
5. Repita los pasos 1.3 y 1.4 para todas las pupas de la línea, luego deje la corredera de cinta adhesiva doble a un lado.
6. Con las tijeras finas, corte el abdomen de la pupa lejos del tórax y empújelo en una pila separada (Figura 1D,D'). Repita para las pupas restantes.
   NOTA: Comience a cronometrar la duración de la disección con el paso 1.6, tan pronto como se interrumpa la integridad de la pupa. Diseccionar tantas moscas como sea posible en 20-30 minutos para prevenir la muerte celular y los cambios transcriptómicos y proteómicos asociados. Al diseccionar adultos de 1 día o pupas de >90 h, a menudo es conveniente para los pasos posteriores eliminar adicionalmente la cabeza con las tijeras finas.
7. Con un pañuelo de papel, retire la mayor parte del 1x PBS (generalmente turbio con grasa en suspensión), así como la pila de abdomenes (Figura 1E). Agregue una gota de 1x PBS fresco y frío a los tórax restantes.
8. Utilice las tijeras para cortar el tórax por la mitad (Figura 1F,F') cortando desde la cabeza hacia abajo el eje longitudinal del cuerpo en un solo movimiento. Alternativamente, si se ha extraído la cabeza, primero inserte las tijeras donde estaba unida la cabeza y corte la mitad superior del tórax longitudinalmente entre los IFM. Luego, corte el lado ventral del tórax con un segundo corte en la misma orientación.
9. Repita los pasos 1.7 y 1.8 para diseccionar todas las pupas, generando una pila de hemisecciones de tórax cerca del centro del portaobjetos. Asegúrese de que haya suficiente PBS 1x refrigerado en el portaobjetos para que las hemisecciones no se sequen.
   NOTA: Después de 48 h de APF, los IFM son lo suficientemente grandes como para ser visibles bajo un microscopio de disección estándar para el ojo entrenado. En este punto del protocolo, los músculos con una etiqueta fluorescente se pueden mover a un endoscopio de disección fluorescente para ayudar en la identificación de IFM o con fines de entrenamiento, pero esto no es necesario.
10. Disecciona los IFM del tórax. Aísle una de las hemisecciones usando las pinzas #5 (Figura 1G,H). Inserte suavemente las puntas de una pinza por encima y por debajo del centro de los IFM (Figura 1G',H'). Mientras mantiene las primeras pinzas quietas, use unas tijeras finas para cortar un extremo del IFM de la cutícula y los tendones. A continuación, corte el otro extremo del IFM para liberarlo de la cutícula (Figura 1G'',H'').
    NOTA: Dependiendo de la orientación del tórax después del primer corte IFM, es útil girar el tórax 180° para que el segundo corte IFM sea más fácil de realizar.
11. Retire el haz de IFM del tórax con pinzas (Figura 1G''',H'''), transfiriéndolo al borde de la burbuja de PBS para usar la tensión del agua para mantenerlo en su lugar (Figura 1I). Empuje la carcasa hacia el lado opuesto de la corredera. Repita para las hemisecciones de tórax restantes, generando una colección de IFMs disecados.
    NOTA: Si los IFM no permanecen en una pila ordenada, retire algunos de los 1x PBS con un pañuelo de papel. Tenga cuidado de no dejar que todo el PBS se evapore y asegúrese de que los IFM y hemitórax disecados permanezcan cubiertos por un tampón.
12. Después de diseccionar todos los IFM, realice rápidamente un control de calidad en el músculo disecado. Usando las pinzas #5, retire cualquier músculo de salto o fragmentos de cutícula que puedan haber encontrado su camino en la muestra (Figura 1J-K'').
    NOTA: El músculo de salto parece diferente del IFM. Si se disecciona el músculo marcado con Mef2-Gal4 bajo fluorescencia, el músculo de salto tiene una fluorescencia más débil y una forma y textura diferentes. Bajo luz normal, parece casi translúcido, mientras que los IFM son de un amarillo opaco y lechoso (Figura 1J-J'',K).
13. Usando la tensión del agua, capture (pero no aplaste) los IFM diseccionados entre un par de pinzas (Figura 1L). Transfiera los IFM a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL precargado con 250 μL de PBS 1x refrigerado (Figura 1M). Proceda inmediatamente con la sección 2.
    NOTA: Cuando las puntas de las pinzas se acercan unas a otras y se levantan de una solución tampón, la tensión del agua hace que se capture una burbuja de tampón entre las puntas de las pinzas. Si los IFM también están presentes en esta burbuja, pueden sacarse de la solución y transferirse fácilmente a otro receptáculo lleno de tampón. Es importante apretar las pinzas para acercar las puntas entre sí sin tocarse entre sí, para evitar macerar el tejido capturado en la burbuja tampón.

2. Pellet y conservar la muestra IFM

1. Granule los IFM centrifugando el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL durante 3-5 min a 2.000 x g en una centrífuga de sobremesa (Figura 2A,B).
2. Retire el tampón con una punta de pipeta (Figura 2C).
3. Para aplicaciones de ARN, vuelva a suspender el pellet de IFM en 50-100 μL del tampón de aislamiento de ARN deseado (consulte la Tabla de Materiales, Figura 2D). De lo contrario, continúe con el paso 2.4.
   NOTA: Los IFM se pueden congelar en seco después del paso 2.2 para preparaciones de espectrometría de masas o aislamiento de ARN con kits comerciales (ver resultados representativos). Para aplicaciones de ARN, se obtienen mejores resultados al resuspender y congelar inmediatamente el pellet de IFM en tampón de aislamiento.
4. Congele la muestra en hielo seco o congele rápidamente en nitrógeno líquido (Figura 2E). Almacene a -80 °C hasta que esté listo para los pasos posteriores en la preparación de la muestra para el análisis posterior.
   NOTA: Después de la criopreservación, las muestras pueden almacenarse durante varios meses antes de procesarse para la investigación posterior.

Resultados

Figura 1: Disección de IFMs después de 48 h APF. (A) Alineación de pupas en cinta adhesiva de doble adherencia. (B) Extracción de las pupas de la caja de la pupa abriéndola anteriormente, cortando la caja dorsalmente (B') y levantando la pupa (B''). Los símbolos circulares representados igual que en la Figura 2. (C) Tran...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo de 60 mm	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Platos Greiner, 60 mm x 15 mM, ventilados
Cámara del teléfono celular, Samsung Galaxy S9	Samsung (Estados Unidos)	SM-G960F/DS	Se utiliza para fotos que no se toman con un microscopio
Cinta adhesiva doble	Escocés/3M	ID de 3M 70005108587	Cinta adhesiva de doble cara, disponible en la mayoría de los manipuladores de suministros de oficina
Pinzas Dumont #5	Herramientas de Bellas Ciencias	11252-20	Pinza de punta recta de acero inoxidable de 11 cm, grado biológico con punta de 0,05 mm x 0,02 mm
cámara microscópica de disección fluorescente, cámara Leica DFC310 FX	Leica		www.leica-microsystems.com
Software de microscopio de disección fluorescente, Leica Application Suite (LAS) versión 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Microscopio de disección fluorescente, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Mosca: Bru1[M2]			Stock de moscas; Este documento
Mosca: Bru1[M3]			Stock de moscas; Este documento
Mosca: Mef2-GAL4	Centro de Valores de Bloomington	BDSC:27390	Culata de mosca
Mosca: salm[1]	Centro de Valores de Bloomington	3274	Culata de mosca
Mosca: salm[FRT]			Stock de moscas; véase Spletter et al., Elife, 2018
Mosca: UAS-Bru1IR	Centro de Investigación Drosophila de Viena	GD41568	Culata de moscas, horquilla de ARNi
Mosca: UAS-GFP::Gma	Centro de Valores de Bloomington	BDSC:31776	Culata de mosca
Mosca: UAS-mCD8a::GFP	Centro de Valores de Bloomington	BDSC:5130	Culata de mosca
Mosca: w[1118]	Centro de Valores de Bloomington	3605	Culata de mosca
Mosca: weeP26			Stock de moscas; véase Clyne et al., Genetics, 2003
reactivo de detección de GFP, GFP-Booster	ChromoTek	GBA488-100
glucógeno	Invitrogen	10814-010
Software de procesamiento de imágenes, Photoshop CS6	adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Método 1 (aislamiento de ARN): TRIzol	Tecnologías de la Vida	15596018	Solución monofásica de isotiocianato de guanidinio y fenol
Método 2 (Aislamiento de ARN): Método 1 + Kit TURBO sin ADN	Invitrogen	AM1907	Aislamiento de TRIzol seguido de un tratamiento con un kit para eliminar el ADN
Método 3 (aislamiento de ARN): Kit Miniprep Plus de ARN de zol	Investigación de Zymo	R2070S	Aislamiento de ARN en TRIzol, pero sobre columnas comerciales en lugar de utilizar la separación de fases. Tratamiento recomendado con DNasa realizado con Monarch Dnase I en tampón de reacción de Monarch DNasa I.
Método 4 (aislamiento de ARN): Mini kit RNeasy Plus	Qiagen	74134	Se utilizó el tratamiento con DNasa proporcionado. Los gránulos de IFM se homogeneizaron en tampón RTL como se sugiere para tejidos animales.
Método 5 (aislamiento de ARN): Sistema de minipreparación de tejido de ARN ReliaPrep	Promega	Z6110	Se aplicó el protocolo de 'Purificación de ARN de Tejidos Fibrosos'.
Método 6 (aislamiento de ARN): Kit de minipreparación de ARN total Monarch	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	T2010G	Aplicamos el protocolo para tejidos/leucocitos y lisamos en 300 μL de reactivo de protección de ARN.
Tubos de microcentrífuga	Termo Fisher	AM12400	Tubos de microfuga sin RNasa, 1,5 mL
Portaobjetos de microscopio	Termo Fisher	12342108	Correderas estándar, sin carga, 1 mm
pincel	Marabú	1910000000	Marabú Fino Redondo Nº 0, o pincel similar de cualquier material de arte
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich	158127
Búfer PBS (1x)	Sigma-Aldrich	P4417	Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato para soluciones de 1 L, pH 7,4
Puntas de pipeta PFA PureTip	Científico Elemental	ES-7000-0101	Sustituto opcional de las puntas de pipeta estándar para reducir la pérdida de muestra; 100 ml, orificio de 0,8 mm
Puntas de pipeta	Sigma-Aldrich	P5161	Puntas de pipeta universales de 200 ml
Enfoque 1 de concentración de ARN y trazas de integridad de ARN, Bioanalyzer	Tecnologías Agilent	G2939BA
Concentración de ARN Approach 2, Nanodrop	Termo Fisher	ND-2000
Concentración de ARN Approach 3, Qubit 4 Fluorímetro	Invitrogen	Pregunta 33238
ARNasa A	Promega	A7937
Agua libre de RNasa, pirocarbonato de dietilo (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	El DEPC trata el agua durante la noche y luego se esteriliza en autoclave para eliminar toda la RNasa.
Kit RT #1: Kit de transcripción inversa Super Script III	Invitrogen	18080-044	Kit de transcripción inversa
Kit RT #2: LunaScript	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	E3010S	Kit de transcripción inversa
Kit RT #3: Kit de transcripción inversa QuantiNova	Qiagen	205410	Kit de transcripción inversa
Software estadístico: GraphPad Prism	Prisma GraphPad		www.graphpad.com
Software estadístico: Microscoft Excel	Microsoft		Comprado como parte del paquete: Office Hogar y Estudiantes 2019
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	5405000760	Centrífuga Eppendorf 5425 o equivalente
Pañuelos de papel/ Toallitas Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Toallitas de papel tisú estándar
Pipeta de transferencia	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipeta de plástico
Tijeras de resorte Vannas	Herramientas de Bellas Ciencias	15000-00	Filo de corte de 3 mm, diámetro de la punta 0,05 mm, longitud 8 cm
Papel Whatman	Sigma-Aldrich	1004-070	Círculos de papel de filtro, Grado 4, 70 mm

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