Drosophila in vivo Imágenes de calcio: un método para obtener imágenes funcionales de la actividad neuronal

Este protocolo es un extracto de Hancock et al., Imágenes ópticas de calcio in vivo de la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje en Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).

1. Imágenes de calcio in vivo

1. Utilice un microscopio multifotónico equipado con un láser infrarrojo y un objetivo de inmersión en agua (ver Tabla de Materiales), instalado sobre una mesa aislada de vibraciones. Para la visualización de indicadores de calcio basados en GFP, ajuste el láser a una longitud de onda de excitación de 920 nm e instale un filtro de paso de banda GFP.
2. Con la perilla de ajuste Z gruesa, escanee el eje Z del cerebro y localice la región cerebral de interés. Utilice la función de recorte para enfocar el escaneo solo en esta área para minimizar el tiempo de escaneo y para rotar la vista de escaneo de modo que la parte anterior de la cabeza quede hacia abajo.
3. Ajusta el tamaño del fotograma a 512 x 512 px, la velocidad de escaneo a > 4 Hz y la región de escaneo (en la dimensión Y) para que las neuronas de interés estén cubiertas.

2. Visualización de transitorios de calcio evocados por olores a través del condicionamiento olfativo

1. Utilice un sistema de entrega de olores que pueda entregar varios estímulos de olor de una manera temporalmente precisa.
   1. Utilice una computadora adicional para controlar el dispositivo y comunicarse con el software del microscopio de imágenes para coordinar las estimulaciones de olores con la captura de imágenes durante los experimentos.
   2. Inicie un paquete de macros preprogramado capaz de vincular el software de adquisición de imágenes y el programa de entrega de olores (por ejemplo, un paquete de macros VBA instalado en el software de control del microscopio, consulte la Tabla de materiales) que responde a un disparador de entrada externo proporcionado por el inicio de un protocolo de entrega de olores en un programa separado).
2. Comience la medición monitoreando los transitorios de calcio evocados por olores "previos" / ingenuos a una resolución de 512 x 512 px y una velocidad de fotogramas de 4 Hz. Proporcione un estímulo de olor de 2,5 s flanqueado por una adquisición de imágenes adicional durante 6,25 s antes del inicio del olor (para establecer un valor de referencia de F₀) y 12,5 s después de la compensación de olores. Repita esto con un segundo odorante y luego con un tercer odorante.
3. Continúe 3 minutos después de esta medición con el acondicionamiento clásico ("entrenamiento") de la mosca.
   1. Seleccione uno de los olores presentados en la fase de "pre-entrenamiento" para que se convierta en el olor CS⁺ y otro para que se convierta en el olor CS-. Presente el olor CS⁺ utilizando el sistema de entrega de olores controlado por computadora durante 60 s junto con doce descargas eléctricas de 90 V.
   2. Después de un descanso de 60 s, presente el olor CS solo durante 60 s. Use como odorantes 4-metilciclohexanol y 3-octanol. No presente el tercer odorante (por ejemplo, 1-octen-3-ol) durante este entrenamiento, ya que se utiliza como control solo antes (paso 2.2.) y después (paso 2.4) de la fase de entrenamiento.
4. Mida nuevamente los transitorios de calcio evocados por el olor "post-entrenamiento" repitiendo el protocolo de estimulación de olores "pre-entrenamiento" (paso 2.2.) 3 min después de terminar la fase de entrenamiento (paso 2.3).
   NOTA: El momento de este paso debe reflejar el tiempo de interés después de la formación de la memoria (por ejemplo, realizar este paso 3-4 minutos después del paso de condicionamiento para investigar la memoria a corto plazo). Por lo general, las moscas pueden sobrevivir durante varias horas en esta preparación.
5. Guarde los archivos de imagen en un formato adecuado (por ejemplo, Tiff) para su posterior análisis de imágenes.