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Este protocolo es un extracto de Gervaise y Arur, Análisis Espacial y Temporal de ERK Activo en la Línea Germinal de C. elegans. J. Vis. Exp.(2016).
>1. Disección de gusanos adultos para la obtención de gónadas
- Elija 100 - 150 WT (N2) o el genotipo deseado de gusanos en la etapa de desarrollo deseada y específica (L1, L2, L3, L4, adulto, etc.) en 100 μL de tampón M9 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Llene el tubo de microcentrífuga con 900 μL de tampón M9 (consulte la tabla de materiales). Centrifugar los tubos a 1.000 x g en una microcentrífuga durante 1 min a temperatura ambiente.
- Retire con cuidado 900 μL del tampón M9 y deséchelo. Retire el tampón bajo un microscopio de disección para asegurarse de que los gusanos no se eliminen accidentalmente.
- Repita los pasos 1.2 a 1.3 dos veces más con un búfer M9 nuevo cada vez. Esto asegura que cualquier bacteria que se haya arrastrado con los gusanos se elimine de manera efectiva.
- Después del lavado final, retire 900 μL de tampón M9 del tubo y deséchelo.
- Transfiera los 100 μL restantes de tampón M9 que contiene los 100 - 150 gusanos con una punta de micropipeta de 200 μL a una placa de reloj de vidrio de fondo plano. Asegúrese de que la punta de la micropipeta esté cortada en la marca de 10 μL antes de usarla. Si no se corta la punta, los gusanos se cortarán.
- Añadir 1 - 3 μL de levamisol 0,1 M a la placa de cristal del reloj que contiene los gusanos en tampón M9. Agite suavemente el levamisol y el M9 para permitir una mezcla uniforme hasta que los gusanos dejen de moverse.
NOTA: Las existencias de levamisol pueden almacenarse a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo. En este caso, se utiliza la concentración más alta de 1 a 3 mM que la descrita en la literatura23 de 0,2 - 0,25 mM de levamisol para obtener una pérdida rápida de movilidad en los animales. Si los animales se desollan durante demasiado tiempo en la suspensión líquida, los patrones resultantes de dpERK en las gónadas pueden ser variables (debido al estrés o a la falta de nutrición, o a ambos). Se han logrado patrones de tinción más reproducibles con 1 - 3 mM de levamisol para la disección.
- Conecte dos agujas de 25 G a dos jeringas de 1 mL (el tamaño de la jeringa no importa, el calibre de la aguja es crítico). Coloque una jeringa en cada mano (Figura 1).
- Bajo un microscopio de disección, coloque cada aguja debajo y sobre cada gusano como se muestra en la Figura 1 y coloque un corte fino en el gusano cerca del segundo bulbo faríngeo con un movimiento similar al de una tijera. Después de un corte en el gusano><, pase al siguiente animal hasta que todos los animales en el plato hayan sido cortados al menos una vez.
NOTA: Tenga en cuenta que los pasos 1.8 y 1.9 son sensibles al tiempo. Diseccione todos los gusanos de la placa en menos de cinco minutos para obtener un patrón dpERK reproducible. Los tiempos de disección más largos darán como resultado un apagado de la señal dpERK, especialmente en la Zona 1. Ajuste el número de lombrices por ronda de disección (es decir, 50 lombrices frente a 150) si es necesario para permanecer en el período de tiempo asignado.
- En caso de que una gónada extruida no sea visible durante la disección, no intente otro corte en el mismo animal. Por lo general, eso solo cortará al animal y no resultará en la extrusión de la gónada. En su lugar, pasa al siguiente animal. Los gusanos donde las gónadas no se extruyen aparecerán como tales en los portaobjetos que se harán en la sección 6 y se pueden ignorar durante la toma de imágenes
NOTA: A lo largo de todos los pasos de disección y procesamiento, es importante tener en cuenta que la gónada permanecerá unida al cuerpo/canal. No fuerce la gónada y el cuerpo a separar con la aguja. A menudo, un desgarro aberrante en el tejido gonadal en un intento de separar la gónada del cuerpo puede dar lugar a una señal de anticuerpos espuria. El cuerpo/carcasa se puede ignorar durante los pasos de imagen, y solo se puede obtener una imagen de la gónada. Además, a veces las células intestinales también pueden servir como controles internos/controles somáticos para el anticuerpo que se está analizando.
Figura 1: Demostración de las posiciones de las agujas durante las disecciones. Izquierda: Fotografía de una disección en proceso. Derecha: Posiciones de la aguja con referencia al tornillo sinfín. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
