PCR de un solo gusano: un método para extraer y amplificar el ADN genómico

Resumen

Fuente: Prior, H., et al. Un conducto rápido y sencillo para generar mutantes puntuales genómicos en C. elegans utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

Este video describe una técnica para cribar rápidamente un solo nematodo en busca de un marcador genético mediante cribado por PCR. En el protocolo de ejemplo, seleccionamos la edición del genoma basada en CRISPR.

Protocolo

El siguiente protocolo es un extracto de Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

>PCR y genotipado de gusano único

1. Después de 1 a 2 días de puesta de huevos, transfiera el F₁s a tapas de tubo de tiras de PCR individuales que contengan 7 μL de tampón de lisis de lombriz utilizando un palillo de lombriz (Tabla 1, Figura 1D, día 4 - 5).
2. Centrifugar los tubos de PCR a velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente para llevar a los animales al fondo del tubo, y congelar los tubos a -80 °C durante 1 h.
   NOTA: Los gusanos pueden almacenarse a -80 °C indefinidamente.
3. Limente lombrices congeladas en un termociclador utilizando el siguiente programa: 60 °C durante 60 min, 95 °C durante 15 min, 4 °C de retención.
4. Configuración de la mezcla maestra de PCR como se muestra en la Tabla 2.
5. Agregue 21 μL de mezcla maestra de PCR en tubos de PCR limpios y luego agregue 4 μL de lisis de lombriz desde el paso 3. Mezcle bien con una pipeta y ejecute el programa de PCR siguiendo las pautas del fabricante (consulte la tabla de materiales).
6. Purifique las reacciones de PCR utilizando un kit de limpieza y concentración de ADN, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales). Eluye el ADN añadiendo 10 μL de agua a la columna de centrifugación.
7. Preparación de la mezcla maestra de enzimas de restricción como se muestra en la Tabla 3.
8. Añadir 10 μL de la enzima de restricción mastermix a cada reacción de PCR limpia e incubar durante 1 - 2 h a 37 °C.
9. Separe los productos de PCR digeridos en un gel de agarosa al 1,5 % a 120 V utilizando 1 tampón de tris-acetato EDTA (TAE).

Resultados

Figura 1. Ingeniería CRISPR-Cas9 del locus C. eleganssod-1. (A) Ilustración esquemática que representa la estructura exón-intrón del locus sod-1 en C. elegans. La barra roja denota la ubicación de G93 en el exón 3. El conjunto de pares de cebadores se indica con las flechas rojas (F1-R1). (B) Alineación de la s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua libre de nucleasas	Synthego Inc.	proporcionado con el kit de sgRNA kit EZ
KCl	sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Investigación de Zymo	D4004
Kit de Recuperación de ADN en Gel Zymoclean	Investigación de Zymo	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	M0494L
Proteinasa K	sigma	P2308
MgCl2	sigma	M2393
NP-40	sigma	74385
Tween-20	Fisher Científico	BP337-100
Solución de Descontaminación RNaseZap	Fisher Científico	AM9780