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Abstract

Fuente: Escorcia, W., et al. Cuantificación de la Abundancia de Lípidos y Evaluación de la Distribución de Lípidos en Caenorhabditis elegans mediante tinción de Rojo del Nilo y Rojo Aceite O. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe un protocolo para teñir lípidos en gusanos enteros y fijos usando tinte rojo del Nilo. Para ver específicamente los lípidos neutros en el núcleo de las gotas de lípidos, imagine los espectros de emisión verde de los C. elegans teñidos.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Escorcia et al, Cuantificación de la abundancia de lípidos y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

<p class="jove_title">1. Tinción de lípidos con rojo del Nilo (NR)

1. Preparación de 5 mg/mL de solución madre NR
   1. En un frasco de 500 ml, agregue 100 mg de polvo NR a 200 ml de acetona al 100%.
   2. Cubra la botella con papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz.
   3. Antes de usar, agite la solución durante 2 h en la oscuridad.
   4. Para un uso prolongado, almacene la solución madre NR en un frasco herméticamente cerrado sin ninguna exposición a la luz. Escale la solución madre NR de acuerdo con las necesidades de investigación. Asegúrese de que se utilice la misma solución madre en todos los experimentos de tinción NR para obtener resultados de tinción e imágenes uniformes.
2. Preparación de la solución de trabajo NR
   1. Por cada 1 ml de isopropanol al 40% (v/v), agregue 6 μl de solución madre NR.
   2. Prepare 600 μL de solución de trabajo NR para cada muestra.
      NOTA: Prepare una solución de trabajo NR fresca justo antes de teñir. Dependiendo de las necesidades de la solución madre NR, utilice un tubo cónico graduado de 15 mL o 50 mL.
3. Preparación de lombrices para la tinción de lípidos NR
   1. Cultive lombrices hasta la etapa L4 temprana a 20 °C en un medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembrado con E. coli OP50 de registro tardío.
   2. Lave los gusanos de la placa con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato + Triton X-100 (PBST) al 0,01% y coloque la suspensión de gusanos en un tubo de microfuga de 1,5 mL.
   3. Centrifuga las lombrices a 560 x g durante 1 min. Retira el sobrenadante y repite este paso hasta que la E. coli se haya eliminado de la suspensión.
   4. Añadir 100 μL de isopropanol al 40% al pellet de lombriz e incubar a temperatura ambiente durante 3 min.
   5. Centrifugar los gusanos a 560 x g durante 1 min y eliminar el sobrenadante sin alterar la peleta de gusano.
      NOTA: Use volúmenes más altos de PBST para lavar los gusanos de las placas si usa platos más grandes o mancha más gusanos por plato. No lave los gusanos en PBST más de 15 minutos antes de la fijación de la muestra. Realice lavados adicionales si el sobrenadante no está limpio de bacterias. Llevar a cabo la incubación en isopropanol al 40% utilizando un nutator o balancín. Supervise siempre los tubos para asegurarse de que se está produciendo una agitación completa de la muestra.
4. Tinción lipídica con NR
   1. En la oscuridad, agregue 600 μL de solución de trabajo NR a cada muestra. Invierta los tubos tres veces y mezcle completamente los gusanos en la solución NR.
   2. Gire la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.
   3. Después de la incubación, centrifugar los gusanos a 560 x g durante 1 min y eliminar el sobrenadante.
   4. Añadir 600 μL de PBST e incubar las muestras en la oscuridad durante 30 min para eliminar el exceso de tinción NR.
   5. Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y eliminar todo el sobrenadante, excepto aproximadamente 50 μL.
      NOTA: La incubación NR no requiere agitación. El asentamiento de gusanos es común durante este paso.
5. Preparación de portaobjetos para la obtención de imágenes al microscopio
   1. Vuelva a suspender la bolita de gusano en el sobrenadante restante.
   2. Coloque 5 μL de suspensión de gusano en un portaobjetos de microscopio y coloque un cubreobjetos con cuidado para evitar atrapar burbujas de aire.
   3. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas antes de obtener imágenes de los gusanos.
   4. Prepara solo un par de diapositivas a la vez. Esto asegurará que las imágenes de NR permanezcan constantes en todas las muestras. La calidad de las imágenes teñidas con NR disminuye después de 6 h. Las gotas de lípidos discretas son difíciles de observar y la fluorescencia de fondo aumenta, lo que interfiere con la detección de la señal NR.
6. Imágenes de gusanos teñidos con NR
   1. Visualice los gusanos con un aumento de 5X para capturar varios animales por campo de visión.
   2. Cambie a un aumento de 10X para una mejor cuantificación de los gusanos individuales.
   3. Utilice el canal FITC/GFP para obtener imágenes de gusanos teñidos con NR y pruebe diferentes tiempos de exposición para determinar las condiciones óptimas para la cuantificación.
   4. Guarde los archivos en formato TIF para evitar la pérdida de datos debido a la compresión.
      NOTA: Los tiempos de exposición típicos oscilan entre 100 y 1000 ms. Al tener un tiempo de exposición óptimo, utilícelo para todas las muestras para mantener la consistencia de la imagen.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator