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Este protocolo es un extracto de Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
Las cepas tetraploides se pueden validar contando el número de cromosomas en sus ovocitos no fertilizados. La microscopía fluorescente se puede utilizar para detectar el número de pares de cromosomas en ovocitos diploides no fertilizados (antes de las divisiones meióticas), si la cepa tiene un marcador fluorescente para los cromosomas. En ausencia de marcadores cromosómicos fluorescentes, los nematodos tetraploides se pueden cribar fijando los nematodos y tiñéndolos con un tinte de ADN; consulte a continuación un protocolo para la fijación de etanol y la tinción de 4',6-diamidina-2'-fenilindol diclorhidrato (DAPI) de animales enteros.
Tinción de DAPI para animales enteros
NOTA: Las cepas tetraploides que llevan 12 pares de cromosomas conectados pueden validarse mediante la tinción de DAPI en estos animales y contando el número de cuerpos de DAPI en sus ovocitos no fertilizados.
- Coloque de 5 a 10 μL de tampón M9 en un portaobjetos de microscopio, luego transfiera de 6 a 10 nematodos a la gota.
- Bajo un microscopio de disección, extraiga la mayor parte del M9 de la gota sin eliminar los nematodos con un pañuelo de limpieza sin pelusa. A continuación, añada inmediatamente una gota de 10 μL de etanol al 90% sobre los gusanos. Deja que las lombrices se sequen por completo, pero no por más de un par de segundos.
- Tan pronto como el etanol se evapore (esto se puede ver como sucede bajo el microscopio de disección), agregue 10 μL adicionales de etanol al 90% sobre los gusanos.
- Repita el paso 3.1.3 tres veces más.
- Una vez que se haya evaporado la última gota de etanol, agregue 6 μL de colorante DAPI o Hoechst a la concentración final recomendada en el medio de montaje de elección (por ejemplo, una dilución 1:1,000 de una concentración de stock de DAPI de 2 ng/μL en M9). Para el almacenamiento a largo plazo de los portaobjetos, se puede utilizar p-fenilendiamina al 0,5% disuelto en 20 mM de Tris-HCl, pH 8,8, en glicerol al 90% como solución antidecoloración, en lugar de M9 solamente.
- Cubra los gusanos del portaobjetos con un cubreobjetos y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Marque en un microscopio de fluorescencia (paso 3.1.7) al menos 10 minutos después de agregar el cubreobjetos. Los portaobjetos sin antidecoloración pueden almacenarse durante unos días a 4 °C antes de marcar, pero la calidad de la fluorescencia comienza a disminuir después de unos días.
- Usando un microscopio fluorescente con un aumento de 100X, marque el número de cuerpos DAPI individuales (presumiblemente pares de cromosomas individuales) en el ovocito no fertilizado más maduro, que está inmediatamente adyacente a la espermateca y aún no ha entrado en la espermateca o el útero.
- Para marcar los cuerpos individuales de DAPI dentro del núcleo de un ovocito, utilice el enfoque fino del microscopio para moverse lentamente desde la parte superior del núcleo del ovocito hasta la parte inferior durante el recuento. A continuación, vuelva a contar el mismo núcleo mientras mueve el foco en la dirección opuesta (es decir, desde la parte inferior hasta la parte superior del núcleo) para confirmar el número contado de cuerpos DAPI.
- Puntúe el ovocito no fertilizado más maduro en cada una de las dos gónadas en al menos diez hermafroditas por cepa de Lon estable. Los ovocitos de tipo salvaje tienen 6 cuerpos DAPI en promedio, 5 pares de autosomas y el par de cromosomas sexuales. La presencia de 12 cuerpos DAPI en el ovocito de cepas Lon estables indica que los animales de esta cepa son tetraploides parciales (4 juegos de autosomas, 3 cromosomas X) o completos (4 juegos de autosomas, 4 cromosomas X).
- Calcular el número promedio de cuerpos DAPI observados a partir de múltiples (al menos 10) ovocitos por cepa. Algunos pares de cromosomas se tocarán o estarán uno encima del otro, por lo que el número de cuerpos DAPI en un ovocito suele ser menor que el número real de pares de cromosomas.
- (Opcional) Validar aún más cepas estables de Lon en las que el número medio de cuerpos DAPI es 12 para comprobar si son tetraploides completos (4A, 4X) o parciales (4A, 3X) mediante tinción de inmunofluorescencia contra proteínas del eje cromosómico como HTP-3. Esta tinción distinguirá los pares de cromosomas al mostrar un patrón cruciforme de cromosomas individuales no conectados presentes en el tetraploide parcial.