Alimentación de ARNi en cultivo líquido: un método de alto rendimiento para reducir la expresión génica en C. elegans

Resumen

Fuente: Groh, N. et al. Métodos para estudiar los cambios en la agregación inherente de proteínas con la edad en Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi es una poderosa herramienta genética disponible para los investigadores de C. elegans. Este video presenta un método para tratar más gusanos con ARNi que la alimentación en placa mediante el uso de condiciones de cultivo líquido.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Cultivo líquido de animales sin gónadas para recolectar animales jóvenes y envejecidos sometidos a ARNi dirigido a un gen de interés

NOTA: La respuesta de algunos genes al ARNi puede depender de la temperatura como se ha descrito anteriormente. Como alternativa al ARNi, se po....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraz de cultivo de Fernbach	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacidad 2.800 ml, con 3 muescas deflectoras	Sí
Tapón de rosca de membrana	Schott	1E+06	GL45	Sí
Mezclador nutante	VWR	444-0148		Sí
Embudo separador	Nalgene	4300-1000	Capacidad: 1.000 ml	No
Jeringa de 1 ml	BD Plastipak	3E+05		No
Aguja gris, 27 G x 1/2 ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05		No
Filtros de membrana 0,025 μM	Millipore	VSWP04700		No
Tira de pH	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14	No
Cóctel de inhibidores de proteasa	Roche	5E+09	Comprimidos Mini completos sin EDTA	No
Octoxinol-9	Applichem	A1388	Tritón X-100	No
Ácido 4-morfolineetanosulfónico (MES)	Sigma-Aldrich	M1317		No
Nonilfenilpolietilenglicol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)	No
DNaseI	Roche	5E+09	recombinante, libre de RNasa	No
RNasaA	Promega	A7973	solución	No
Tinción de transferencia de proteínas totales	Termopescador	S11791	Tinción de transferencia de proteínas Sypro Ruby	No
Tinción total de gel de proteínas	Termopescador	S12001	Tinción de gel de proteína Sypro Ruby	No
TCEP (clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina)	Serva	36970		No
Yodoacetamida	Serva	26710		No
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	9830		No
Tripsina modificada de grado de secuenciación	Promega	V5111		No
Etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta	Sciex	4E+06	Kit multiplex de reactivos iTRAQ	No
Centrífuga Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05		Sí
Ultracentrífuga Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05		No
centrífuga 5424R	Eppendorf	5E+09		Sí
centrífuga 5702	Eppendorf	6E+09		Sí
Centrífuga Megafuge 40R	Termo Científico	8E+07		No
Concentrador Plus	Eppendorf	5E+09	Evaporador centrífugo	No
Microscopio estereoscópico fluorescente M165 FC	Leica		Con objetivo Planapo 2.0x	No
Microscopio de disección	Leica		Leica S6E	Sí
Microscopio de gran aumento Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Con objetivo PlanAPOCHROMAT 20x y Zeiss Axio Cam MRm	No
software				No
Software de análisis de imágenes	ImagenJ			No
Análisis de datos de espectrometría de masas	Buscador de proteínas		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	No
Cepas de E. coli
OP50	CGC
Bacterias ARNi
L4440	Julie Ahringer Biblioteca de ARNi
Mutantes de C. elegans
CF2253	CGC, nombre de la cepa: EJ1158		Genotipo: gon-2(q388)
Transgénicos de C. elegans
DCD214	El laboratorio de Della David en DZNE Tübingen		Genotipo: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	El laboratorio de Della David en DZNE Tübingen		Genotipo: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]