Alimentación de ARNi en cultivo líquido: un método de alto rendimiento para reducir la expresión génica en C. elegans

Resumen

Fuente: Groh, N. et al. Métodos para estudiar los cambios en la agregación inherente de proteínas con la edad en Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi es una poderosa herramienta genética disponible para los investigadores de C. elegans. Este video presenta un método para tratar más gusanos con ARNi que la alimentación en placa mediante el uso de condiciones de cultivo líquido.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Cultivo líquido de animales sin gónadas para recolectar animales jóvenes y envejecidos sometidos a ARNi dirigido a un gen de interés

NOTA: La respuesta de algunos genes al ARNi puede depender de la temperatura como se ha descrito anteriormente. Como alternativa al ARNi, se podría incorporar un gen mutante en el fondo gon-2(-).

1. Preparación de bacterias para cultivo líquido
   1. Preparar las bacterias OP50 y ARNi (bacterias que producen el dsRNA deseado y bacterias con el vector vacío como control) inoculando 4 L de medio LB con 12 mL del cultivo bacteriano respectivo (añadir una concentración final de 50 μg/mL de carbenicilina y 1 mM de IPTG a los cultivos de bacterias de ARNi) e incubarlas a 37 °C durante la noche a 180 rpm.
   2. Al día siguiente, coseche los cultivos a 6.700 x g durante 10 min a 4 °C. Retire los sobrenadantes y vuelva a suspender cada pellet en un medio basal S helado de 60 mL (100 mM de NaCl, 50 mM de fosfato potásico pH 6, mantenido en hielo). Mantenga los tres gránulos resuspendidos (OP50, bacterias de ARNi de control y bacterias de ARNi para el gen de interés) a 4 °C hasta el paso 1.2.
      NOTA: Los gusanos se pueden cultivar en ARNi desde la etapa L1 o, para evitar defectos de desarrollo, desde la última etapa larvaria L4 (ver paso 1.2).
2. Cultivo líquido para tratamiento con RNAi a partir del último estadio larvario L4
   1. Añadir 200 mL de medio basal S en un matraz de cultivo Fernbach (capacidad 2.800 mL). Para un volumen de cultivo final de 300 mL (ver 1.2.2.4), añadir 10 mM de citrato de potasio, pH 6, 3 mL de solución de metales traza (5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL de carbendazima y 5 μg/mL de colesterol). Cierre el matraz con un tapón de rosca de membrana. Consulte la Tabla 1 para ver las recetas de tampones.
   2. Saca los L1 de 25 °C y transfiérelos a tubos de 15 mL. Centrifugar a 1.900 x g durante 3 min, retirar el sobrenadante y contar los L1 por 2 μL. Añadir 500.000 L1 en el matraz de cultivo Fernbach preparado en el paso anterior.
   3. Agregue OP50 (del paso 1.1) proporcionalmente al número de gusanos. Por ejemplo, para 500.000 gusanos, agregue 60 mL OP50.
   4. Cultivo completo de lombrices con S basal para llevar el volumen total a 300 mL. Incubar el cultivo de lombrices hasta la etapa L4 a 25 °C en una incubadora agitadora a 150 rpm.
   5. Al día siguiente, los gusanos deben ser del tamaño de L4 de tipo salvaje. Para cambiar de bacterias OP50 a RNAi, recoja a los animales en seis tubos de 50 mL, déjelos sedimentar y elimine el sobrenadante. Lave los L4 con M9 para eliminar las bacterias OP50 residuales: centrifugar a 1900 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante y transferir todos los L4 a un tubo de 50 mL. Cuente los L4 por 5 μL (al menos nueve veces). Se necesitan dos veces 50.000 L4 para la colección de gusanos jóvenes y dos veces 100.000 L4 para la colección de gusanos viejos.
   6. Preparar cuatro matraces de cultivo de Fernbach como se describe en el punto 1.2.2.1. Añadir también una concentración final de 50 μg/mL de carbenicilina y 1 mM de IPTG a cada matraz.
   7. Añada las bacterias de ARNi de control y las bacterias de ARNi para el gen de interés (del paso 1.1) proporcionalmente al número de gusanos: Añada 7 mL de las bacterias respectivas por matraz para los gusanos jóvenes y 14 mL por matraz para los gusanos envejecidos.
   8. Agregue 50.000 gusanos por matraz para la colección de gusanos jóvenes y 100.000 gusanos por matraz para la colección de gusanos viejos, y complete los cultivos con S basal para llenar hasta 300 mL. Incubar los cultivos de lombrices (cuatro en total) a 25 °C y 150 rpm.

2. Mantenimiento de cultivos líquidos de C. elegans

1. Recoja periódicamente una alícuota de cada cultivo líquido y colóquela en un portaobjetos de vidrio (alternativamente en una placa de agar) para verificar que no haya contaminaciones. Con un microscopio de disección, verifique los niveles de alimentos bacterianos en el cultivo, especialmente durante la fase de crecimiento. Prepare con antelación 2 L de cultivos de bacterias de ARNi y bacterias ARNi de control para el gen de interés, tal como se describe en el paso 1.1. Agregue estos a los cultivos líquidos de C. elegans si es necesario y mantenga el resto a 4 °C.
2. Comprobar periódicamente que los animales están estériles. La mayoría de los animales no tienen gónada. Dependiendo de la penetrancia de la mutación gon-2, algunos pueden haber abortado estructuras gonadales, pero no se deben observar animales con huevos.

Solución de stock	importe	Concentración final	Comentarios/Descripción
S basal (para 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Fosfato de potasio pH 6)	200 mL		1 M Fosfato potásico pH 6: Para 1 L: 129 g KH2PO4 monobásico, 52 g K2HPO4 dibásico anhidro
1 M Citrato de potasio pH 6 (Para 400 mL: 13,1 g de ácido cítrico monohidratado, 134,4 g de citrato tripotásico monohidratado)	3 mL	10 mM
Solución de metales traza (Para 1 L: 1,86 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Almacene la solución madre en la oscuridad a 4 °C
1 M MgSO4 (Para 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M de CaCl2 (para 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (Para 50 mL: 10 mg en metanol)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL Colesterol (Para 100 mL: 0,5 g en etanol)	300 μL	5 μg/mL

Tabla 1.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraz de cultivo de Fernbach	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacidad 2.800 ml, con 3 muescas deflectoras	Sí
Tapón de rosca de membrana	Schott	1E+06	GL45	Sí
Mezclador nutante	VWR	444-0148		Sí
Embudo separador	Nalgene	4300-1000	Capacidad: 1.000 ml	No
Jeringa de 1 ml	BD Plastipak	3E+05		No
Aguja gris, 27 G x 1/2 ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05		No
Filtros de membrana 0,025 μM	Millipore	VSWP04700		No
Tira de pH	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14	No
Cóctel de inhibidores de proteasa	Roche	5E+09	Comprimidos Mini completos sin EDTA	No
Octoxinol-9	Applichem	A1388	Tritón X-100	No
Ácido 4-morfolineetanosulfónico (MES)	Sigma-Aldrich	M1317		No
Nonilfenilpolietilenglicol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)	No
DNaseI	Roche	5E+09	recombinante, libre de RNasa	No
RNasaA	Promega	A7973	solución	No
Tinción de transferencia de proteínas totales	Termopescador	S11791	Tinción de transferencia de proteínas Sypro Ruby	No
Tinción total de gel de proteínas	Termopescador	S12001	Tinción de gel de proteína Sypro Ruby	No
TCEP (clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina)	Serva	36970		No
Yodoacetamida	Serva	26710		No
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	9830		No
Tripsina modificada de grado de secuenciación	Promega	V5111		No
Etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta	Sciex	4E+06	Kit multiplex de reactivos iTRAQ	No
Centrífuga Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05		Sí
Ultracentrífuga Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05		No
centrífuga 5424R	Eppendorf	5E+09		Sí
centrífuga 5702	Eppendorf	6E+09		Sí
Centrífuga Megafuge 40R	Termo Científico	8E+07		No
Concentrador Plus	Eppendorf	5E+09	Evaporador centrífugo	No
Microscopio estereoscópico fluorescente M165 FC	Leica		Con objetivo Planapo 2.0x	No
Microscopio de disección	Leica		Leica S6E	Sí
Microscopio de gran aumento Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Con objetivo PlanAPOCHROMAT 20x y Zeiss Axio Cam MRm	No
software				No
Software de análisis de imágenes	ImagenJ			No
Análisis de datos de espectrometría de masas	Buscador de proteínas		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	No
Cepas de E. coli
OP50	CGC
Bacterias ARNi
L4440	Julie Ahringer Biblioteca de ARNi
Mutantes de C. elegans
CF2253	CGC, nombre de la cepa: EJ1158		Genotipo: gon-2(q388)
Transgénicos de C. elegans
DCD214	El laboratorio de Della David en DZNE Tübingen		Genotipo: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	El laboratorio de Della David en DZNE Tübingen		Genotipo: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]