Ensayo de olfatómetro de cuatro vías: un método para evaluar las respuestas de olor en Drosophila

Resumen

Fuente: Lin, C.C., et al. Comportamientos olfativos ensayados por el seguimiento informático de Drosophila en un olfatómetro de cuatro cuadrantes. J. Vis. Exp. (2016).

Las moscas de la fruta tienen un sistema olfativo complejo, pueden discriminar cientos de odorantes y utilizan su sentido del olfato para dirigir las decisiones de comportamiento. Este video describe el ensayo del olfatómetro de cuatro vías, un método para estudiar las respuestas del comportamiento olfativo en moscas. El clip de protocolo presentado muestra cómo manejar las moscas de prueba y cuáles son los pasos críticos mientras se realiza el ensayo.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Lin et al., Comportamientos olfativos ensayados por el seguimiento informático de Drosophila en un olfatómetro de cuatro cuadrantes, J. Vis. Exp. (2016).

1. Respuestas conductuales a olores atractivos y repelentes

1. Encienda el controlador de temperatura y ajústelo a 25 °C.
2. Conecte las cámaras de odorantes (odorantes de control y prueba) insertando el tubo a la salida de la cámara de odorante y al accesorio de conexión a presión en la caja de comportamiento.
3. Verifique el caudal en cada cuadrante utilizando el medidor de flujo de aire para asegurarse de que las corrientes de aire de control y odorante sean iguales a 100 ml / min.
4. Limpie la arena de moscas de PTFE y las placas de vidrio con etanol al 70% 2-3 veces y deje que se sequen completamente al aire (~3-4 min).
5. Fije las placas de vidrio a la arena con abrazaderas.
6. Transfiera las moscas sin anestesia CO₂ a la arena a través del orificio de una de las placas de vidrio. Después de la transferencia, coloque una malla circular en el agujero para evitar que las moscas escapen.
   NOTA: Se ha demostrado que la anestesia con CO₂ afecta el comportamiento de Drosophila y no debe usarse dentro de las 24 horas posteriores a un experimento conductual.
7. Coloque la arena con moscas en la cámara hermética a la luz, conecte las cuatro corrientes de aire de control conectando el tubo conectado al accesorio de conexión de empuje en la caja de comportamiento a las esquinas de la arena, cierre la puerta de la cámara y espere de 10 a 15 minutos para que las moscas se aclimaten al nuevo entorno. Si es posible, apague las luces de la sala donde se realizan los experimentos, para evitar posibles fugas de luz mínimas que puedan sesgar el resultado experimental.
8. Realice un experimento de control de 5 a 10 minutos, en el que las moscas se exponen a 4 corrientes de aire de control.
9. Analice los datos inmediatamente (consulte la sección Análisis de datos a continuación) para asegurarse de que las moscas se distribuyan uniformemente en la arena y que el índice de atracción esté cerca de 0. Este paso es esencial, ya que verifica que no haya fuentes incontroladas de preferencia o evitación dentro de la arena (por ejemplo, fugas de luz del exterior, distribución desigual de la temperatura, arena desigual, contaminación por olores, etc.). Si las moscas están distribuidas de manera desigual o su actividad locomotora es baja, deseche las moscas, limpie la arena nuevamente (Paso 1.4) y use un nuevo lote de moscas para repetir el experimento.
10. Conecte la cámara de olor de prueba a la configuración encendiendo las válvulas de 3 vías o volviendo a enchufar los tubos conectores.
11. Ejecute el experimento de prueba durante 5-10 minutos y analice los datos como se discute en la sección 2 a continuación (Figura 1). Las grabaciones de más de 20 minutos pueden dar lugar a archivos de datos que pueden ser difíciles de procesar computacionalmente. Si desea grabaciones experimentales más largas, detenga y reinicie rápidamente el programa de seguimiento. Esto da como resultado un intervalo de ~10 segundos entre las grabaciones experimentales.
12. Deseche las moscas.
13. Limpie las placas de arena y vidrio con etanol al 70% (Paso 1.4) y reemplace los tubos conectores dentro del gabinete hermético a la luz. Para acelerar los experimentos, se puede usar una nueva arena limpia y limpiar la arena sucia mientras se realizan carreras experimentales.
14. Realice otro experimento con un nuevo lote de moscas, si es necesario. Si se realizan varios experimentos el mismo día, tenga mucho cuidado para asegurarse de que no quede ningún odorante en el sistema de una prueba anterior. Normalmente, esto no es un problema con bajas concentraciones de odorantes o con CO₂, pero para estímulos altamente concentrados puede ser necesario un intervalo de hasta 24 horas entre las ejecuciones experimentales. Además, todos los tubos después de los tubos de flujo pueden ser reemplazados si se sospecha contaminación por odorantes durante los experimentos de control. Deje siempre el aire seco encendido entre los experimentos para enjuagar continuamente el sistema.

2. Análisis de datos

NOTA: El software de adquisición de seguimiento de moscas sugerido (detallado en Materiales), rastrea moscas en tiempo real durante la adquisición y guarda la marca de tiempo y las coordenadas de todas las moscas detectadas en formato *.dat. Hemos desarrollado una rutina de Matlab a medida para convertir los datos a un formato de Matlab y analizar los datos. En los materiales complementarios se proporcionan ejemplos de código, pero los detalles de la implementación dependerán del software utilizado para la adquisición de datos.

1. Cargue los datos sin procesar. Cree una máscara espacial que siga los contornos de la arena y aplique la máscara a los datos sin procesar para eliminar todos los puntos de datos que queden fuera de la arena, ya que representan ruido (Figura 2A, Código suplementario MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Elimine todos los puntos de datos que se muevan a una velocidad inferior a 0,163 cm/s durante más de 3 segundos, ya que es probable que estos datos sean ruido o generados por moscas que no se mueven (Figura 2B, Código suplementario TemporalFiltering.m).
3. Visualice los puntos de datos restantes trazándolos todos a la vez o como trayectorias individuales (Figura 1, Código Suplementario SingleTrajectoryViewer.m).
   NOTA: La ubicación de los límites de olor en el campo de cuatro probablemente depende de una serie de factores, como las características de cada odorante y las tasas de flujo de aire que se utilizan. Por ejemplo, es probable que los odorantes altamente volátiles llenen el cuadrante de olor más completamente que los odorantes menos volátiles. Por lo tanto, es probable que cada odorante pueda exhibir límites de olor ligeramente diferentes. El uso de un detector de fotoionización para medir los límites de olor puede ser problemático, ya que utiliza un vacío para muestrear el aire de un punto en particular y, por lo tanto, interrumpe la concentración de odorante en ese punto. No obstante, los límites de olor se pueden estimar rápidamente en función de los datos de comportamiento de las moscas. Por ejemplo, un límite de olor basado en las huellas de moscas acumuladas en respuesta a diferentes olores se puede observar claramente en Figura 1C y 1D.
4. Calcular un índice de atracción para determinar si los experimentos de control no generan ninguna respuesta de preferencia, y también para acceder a la respuesta a un estímulo odorante (u optogenético). Para calcular un Índice de Atracción (IA), utilice los últimos 5 minutos de una grabación de control o prueba. Para obtener una medida de atracción que se encuentre entre +1 (atracción absoluta) y -1 (repulsión absoluta), se utiliza la siguiente fórmula para calcular la IA:
   
   donde N_prueba es el número de puntos de datos en el cuadrante de prueba, N_control es el número promedio de puntos de datos en los tres cuadrantes de control. Esta medida es intuitiva, ya que no se indicaría ninguna preferencia mediante valores cercanos a cero. Sin embargo, no indica correctamente la proporción del número total de moscas que se encuentran en el cuadrante odorífero. Para obtener esta medida, se puede utilizar un Índice Porcentual (IP):
   
   donde N_prueba es el número de puntos de datos en el cuadrante de prueba, y N_total es el número total de puntos de datos en los cuatro cuadrantes. Esta fórmula proporciona una medida que se encuentra entre 0 y 1, donde 0,25 no corresponde a ninguna preferencia de comportamiento (Figura 1E y 2C, Código Suplementario AttractionIndex.m).
5. Ejecute de 5 a 10 repeticiones de cada condición experimental, usando un nuevo grupo de moscas para cada repetición. Compare los índices de atracción entre condiciones o contra controles utilizando la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov (Figura 1F, función kstest2 en Matlab).

Resultados

Figura 1: Ejemplo de datos generados mediante un ensayo olfativo de cuatro campos. (A) Esquema de la arena de cuatro campos. (B) Se observan respuestas neutras cuando los cuatro cuadrantes contienen solo perfusión de aire seco. (C) Respuestas de atracción a una dilución del 6,25% de vinagre de sidra de manzana perfundido desde el cuadrante superior izquierdo. (D<...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de suministro de aire			(Cantidad necesaria)
Tubos y conectores
Colectores termoplásticos NPT(F)	Cole-Parmer, Illinois, Estados Unidos	R-31522-31	1
Boquilla reductora hexagonal (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5232T314	1
Tubería (ID:1/8)	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5108K43	50 pies
Tubería (ID:1/16)	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	52355K41	100 pies
Racores de tubo de púas	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5117K71	1 paquete
Racores de tubo push-to-connect	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5779K102	4
Racores de tubo de púas (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5463K439	1 paquete (10)
Racores de tubo de púas (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5463K438	Paquete de 2 (10)
Racores de tubo de púas (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5463K4	Paquete de 2 (10)
Racores de tubo de púas (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	5670K84	1
Tapón de cabeza hexagonal	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	48335K152	1
Regulador de presión de aire, filtro de aire y caudalímetros			(Cantidad necesaria)
Unidad de secado de gas de laboratorio	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, EE. UU.	Modelo: L68-NP-303; stock #26840	1
Cuadros multitubo para tubos de flujo de 150 mm	Cole-Parmer, Illinois, Estados Unidos	R03215-30	1
Cuadros multitubo para tubos de flujo de 150 mm	Cole-Parmer, Illinois, Estados Unidos	R03215-76	1
Tubos de caudal de 150 mm	Cole-Parmer, Illinois, Estados Unidos	R-03217-15	9
Cartucho de válvula	Cole-Parmer, Illinois, Estados Unidos	R-03218-72	9
Regulador de aire de precisión	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	6162K13	1
Válvulas solenioides	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Controlador de válvula solenoide	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Ene	1
Caudalímetro electrónico	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) y un	Instrumentos Nacionales	NI USB-6009	1
fuente de alimentación	Instrumentos Extech	382200	1
Cámaras de olor
Tarro de polipropileno de boca ancha 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	Se requieren al menos 5 por experimento, pero se requiere una cámara separada para cada dilución de cada odorante. Disponible en Container Store, parte #635114)
Cámara de olor de vidrio, 0.25 oz	Botella Sunburst	LB4B	Se requieren al menos 5 por experimento
Válvula de entrada para la cámara de olores	Smart Products, Inc., CA, EE. UU.	214224PB-0011S000-4074	1 de estas piezas se usa por cámara de olor, pero deben reemplazarse con frecuencia
Válvula de salida para la cámara de olores	Smart Products, Inc., CA, EE. UU.	224214PB-0011S000-4074	1 de estas piezas se usa por cámara de olor, pero deben reemplazarse con frecuencia
Anillo tórico	RT Dygert International, MN, EE. UU.	AS568-029 BUNA-N O-R	1 paquete (100)
Arena de vuelo, cámara y cajas de comportamiento			(Cantidad necesaria)
Comportamiento y material de la caja de la cámara	Plásticos interestatales, CA, EE. UU.	Extruido ABS negro (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 pulgadas cuadradas
Teflón para inserciones de arena de mosca y cámara de olor, 3/8" de grosor, 12" x 12"	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	8545K27	1
Placas de vidrio, 1/8" de grosor, 9" x 9"	McMaster-Carr, Illinois, Estados Unidos	8476K191	número arábigo
Controlador termoeléctrico de doble acción	WAtronix Inc, CA, Estados Unidos	DA12V-K-0	1
Matriz de LED IR	Iluminación avanzada, Rochester, VT, EE. UU.	AL4554-88024, PS24-TL	2 matrices de LED y una fuente de alimentación
Unidad de aire acondicionado	Tienda Melcor	MAA280T-12	1
Sistema de imagen			(Cantidad necesaria)
Lente Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) con montura C	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NUEVA YORK, EE. UU.	PEC21211 KP	1
Cable de interconexión CCXC-12P05N	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NUEVA YORK, EE. UU.	SOCCXC12P05N	1
Adaptador de cámara DC-700	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NUEVA YORK, EE. UU.	SODC700	1
B+W 40,5 093 Filtro IR	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NUEVA YORK, EE. UU.	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Polarizador circular	amazona		1
Cámara de vídeo IR	Fuente de visión industrial, FL, EE. UU.	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
Convertidor de vídeo USB	The Imagingsource, Carolina del Norte, EE. UU.	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (software de seguimiento de moscas)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
Software de captura de circuitos integrados	The Imagingsource, Carolina del Norte, EE. UU.	(http://www.theimagingsource.com/)
misceláneo			(Cantidad necesaria)
Herramienta rotativa Dremel	Dremel, Racine, Wisconsin, Estados Unidos	Dremel 8000-03	1
Brocas diamantadas para el corte de vidrio	Disponible de varios proveedores; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1