Drosophila Ensayo de laberinto en Y: un método para evaluar las respuestas olfativas en moscas

En este artículo

Resumen

Fuente: Simonnet, M. M., et al. Probando el olfato de Drosophila con un ensayo de laberinto en Y. J. Vis. Exp. (2014).

Este video describe un método para probar el comportamiento exploratorio olfativo en la mosca de la fruta, llamado el laberinto Y. El clip de protocolo destacado muestra cómo configurar y realizar el ensayo.

Protocolo

Este texto de protocolo es un extracto de Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Antes de empezar

Utilice una culata de referencia isogenizada con fenotipos de comportamiento estables y robustos. No existe una regla general para elegir este stock, ya que todos los controles potenciales pueden llevar alelos de fondo heterogéneos.
Utilice esta deformación de control para retrocruzar todas las demás existencias necesarias para los pasos posteriores. Este paso de retrocruzamiento suele estar representado por al menos 5 cruces sucesivos de una sola hembra virgen (para permitir el posible cruce entre cromosomas homólogos) con 2-3 machos de referencia isogénicos. Este paso es importante para homogeneizar el fondo genético entre las diferentes poblaciones de moscas.
Mantener las existencias de Drosophila en un medio estándar de harina de maíz (9%), levadura (10%) y agar (1,5%) complementado con antibiótico (0,4% de para-hidroxi-benzoato de metilo) en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 25 °C.
Realizar experimentos quimiosensoriales en una habitación con temperatura controlada (25 °C) bajo luz roja lejana (para eliminar la contribución de señales visuales y concentrarse en las señales quimiosensoriales). Renueve regularmente el aire de la habitación para ventilar el área entre cada experimento.

2. Respuesta olfativa mediante un ensayo de laberinto en Y

Deje morir de hambre a las moscas durante 16 a 18 horas a 25 °C en tubos de vidrio que contengan una toalla de papel húmeda antes de realizar la prueba.
Conecte un conector en forma de Y a dos viales de vidrio y a un vial de plástico más pequeño (vial de carga). Utilice puntas de pipeta de 1 ml que atraviesan los tapones de espuma para conectar el conector a los tres viales y obtener un laberinto en Y herméticamente sellado. Corte los extremos estrechos de dos puntas de pipeta (~2 mm de diámetro, para evitar cualquier regreso de la mosca una vez que haya tomado su decisión) para formar dos viales de "trampa", y un extremo grande de una punta de pipeta para formar el tubo de "carga" (Figura 1A).
Justo antes de conectar los viales "trampa" (Figura 1B), coloque un papel de filtro de ~6 mm de diámetro en cada vial. Añadir 40 μl de solución odorante en un papel de filtro y 40 μl del disolvente correspondiente en el segundo papel de filtro.
Introduzca diez moscas de 4 a 9 días de edad en el vial de "carga". No use anestesia con CO₂ durante esta transferencia, ya que tiene un fuerte efecto sobre el comportamiento. En su lugar, utilice un breve enfriamiento sobre hielo. La manipulación adecuada de las moscas anestesiadas es importante para limitar el estrés en los sujetos tanto como sea posible.
1. Realice una serie de pruebas de laberinto en Y a 25 °C bajo luz roja lejana (usando bombillas LED para limitar la posible fuente de calor) para evitar los estímulos visuales tanto como sea posible. Tenga cuidado de alternar las orientaciones de los laberintos en Y (tubo que contiene odorante a la izquierda o a la derecha, y tubo de carga en el frente o en la parte trasera; Figura 1C).
2. Espere varias horas para que las moscas entren en el frasco de la trampa que contiene el odorante o el solvente. El conteo vuela después de 24 horas para aumentar la participación hasta más del 80% y proporcionar el máximo valor del índice olfativo (Simonnet, comunicación personal).
3. Calcule el índice olfativo resultante utilizando la siguiente fórmula: (número en el tubo de olor - número en el tubo de disolvente)/número total de moscas cargadas.
Lave la configuración del laberinto en Y de la siguiente manera: remoje la configuración desmontada en RBS 35 MD durante la noche. Enjuague bien con agua del grifo. Finalmente enjuague con agua desionizada y deje secar.

3. Análisis estadístico de los datos

Realice una prueba t, un ANOVA de un factor o un ANOVA de dos factores en función de los datos y las variables.

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Resultados

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Figura 1: Respuesta olfativa masculina evaluada con una configuración de laberinto en Y. A) Dispositivo dividido. B) Dispositivo ensamblado. C) Puesta en condiciones de funcionamiento bajo luz roja lejana. D) Cuantificación de las respuestas olfativas masculinas frente al ácido acético (AA) o el ácido fenilacético (PAA) ambos diluidos en agua destilada (...