Este protocolo es un extracto de Brust-Mascher y Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).
Recetas:
Platos de jugo de uva:
- 5,5 g de agar bacto
- 14,5 g de dextrosa o glucosa
- 7,15 g de sacarosa
- 45 ml de zumo de uva concentrado (100% zumo).
- 204,5 ml H20
- 625 μl de NaOH 10N
Mezcle todos los ingredientes y cocine en el microondas hasta que hierva.
Añadir 2,8 ml de mezcla de ácido (mezcla de ácido: 20,9 ml de ácido propiónico, 2,1 ml de ácido fosfórico, 27 ml de H20)
Mezclar y verter en placas de Petri de 35 mm. Deje solidificar a temperatura ambiente durante uno o dos días. Si las placas no se van a utilizar pronto, selle con parafilm y manténgalas a 4 °C (deje que se equilibren a RT antes de usarlas).
Pasta de levadura:
Disuelva aproximadamente una cucharadita de levadura (Sigma YSC2, levadura de Saccharomyces cerevisiae tipo II) en agua para formar una pasta espesa. Coloque una pequeña cantidad de esto en cada plato de jugo de uva justo antes de usar.
Tampón de inyección:
- 150 mM K-Aspartato
- 10 mM de fosfato K
- 20 mM de imidazol, pH 7,2
Pegamento de heptano:
Desenrolle la cinta adhesiva doble y colóquela en una botella de 100 ml, agregue aproximadamente 50 ml de heptano, selle la botella y recoja durante varios días. Cuando lo use, agregue heptano si el pegamento es demasiado espeso.
Cámara de deshidratación:
Tome una placa de Petri de 100 mm, coloque una parte de una placa de 35 mm dentro para hacer una "mesa" y agregue Drierite (sulfato de calcio anhidro) alrededor de ella para que la altura de Drierite no sea mayor que la "mesa" y cubra. El cubreobjetos con los embriones se colocará en esta "mesa" para su deshidratación antes de la inyección. Es una buena idea usar al menos algo de Drierita indicadora y cambiarla cuando haya cambiado de color.
Protocolo:
Este protocolo se puede utilizar para la inyección de prácticamente cualquier reactivo soluble en el embrión sincitial de Drosophila: por ejemplo, una proteína fluorescente para observación o un inhibidor de proteína diana o ambos.
1. Colección de embriones
- Coloque un nuevo plato de jugo de uva en la jaula de puesta.
- Retire este plato después de una hora, esta es la primera recolección del día y, a menudo, no es muy buena. Se puede descartar.
- Cambie el plato cada hora para seguir recolectando embriones durante una hora cada uno.
2. Preparación del cubreobjetos
- Coloque un cubreobjetos de 50 x 22 mm en un lado de un portaobjetos de microscopio. Pega las cuatro esquinas a la corredera para que no se mueva.
- Con un aplicador con punta de algodón, coloque una capa de pegamento de heptano en una línea en el cubreobjetos (el pegamento no debe ser viscoso y debe secarse en unos segundos, de lo contrario, agregue más heptano).
- Coloca un pedazo de cinta adhesiva doble en el portaobjetos hacia el costado del cubreobjetos.
3. Preparación del embrión
NOTA: Los embriones deben ser fotografiados aproximadamente 2 horas después del inicio de la recolección, así que comience los siguientes pasos permitiendo tiempo suficiente para terminarlos dentro de este marco de tiempo.
- Con un cepillo humedecido, recoja cuidadosamente los embriones del plato de jugo de uva y colóquelos en cinta adhesiva doble en el portaobjetos.
- Usando la parte exterior de las pinzas, enrolle los embriones sobre la cinta adhesiva doble hasta que el corion (la membrana externa) se abra.
- Recoja el embrión haciéndolo rodar suavemente sobre el corion para que se pegue a la pinza y colóquelo sobre el pegamento de heptano en el cubreobjetos con el lado largo del embrión paralelo al lado largo del cubreobjetos. Coloque de 10 a 20 embriones en una fila.
- Retire el cubreobjetos y colóquelo en la cámara de deshidratación durante 3 a 8 minutos (esto depende de la humedad de la habitación y de la cantidad a inyectar).
- Coloque en una cámara de metal con grasa al vacío.
- Cubra los embriones con aceite de halocarbono 700 para evitar una mayor deshidratación. Los embriones ya están listos para la inyección.
4. Inyección de embriones
- Encuentra los embriones bajo un objetivo de 16x.
- Aleja los embriones y encuentra la aguja sin mover el plano focal.
- Centre la aguja y muévala hacia arriba sin moverla en la dirección x o y.
- Si la aguja no está abierta, coloque el borde del cubreobjetos en el campo de visión, pero no donde estará la aguja, y baje la aguja al mismo plano focal. Mueva con mucho cuidado el cubreobjetos hasta que golpee la aguja y la abra suavemente. Si la aguja está abierta, vaya al paso 5. (Las agujas se pueden abrir con ácido fluorhídrico antes de llenarlas).
- Coloque los embriones a la vista (pero no donde estará la aguja), sumerja la aguja en el aceite y asegúrese de obtener buenas gotas líquidas de la aguja.
- Con cuidado pero de manera constante, mueva el embrión en la aguja e inyecte una gota en el embrión y aleje el embrión. (O siga las instrucciones de su aparato de inyección).
- Una vez que se han inyectado todos los embriones, están listos para ser observados en un microscopio confocal.
