Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
3.9K vistas
⸱
30 de abril de 2023
Fuente: Imura, E., et al. Protocolos para la visualización de órganos esteroidogénicos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).
Este video describe la glándula anular de Drosophila, una compleja estructura endocrina importante para la biosíntesis y secreción de ecdisteroides y otras hormonas. El protocolo presentado demuestra su disección, fijación e inmunotinción.
Este protocolo es un extracto de Imura et al., Protocolos para la visualización de órganos esteroidogénicos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
NOTA: El esquema general de los protocolos se muestra en Figura 1.
1. La disección de la glándula anular larvaria (RG)
NOTA: En D. melanogaster, que pertenece a cyclorrhaphous Diptera, el PG se encuentra dentro de un órgano endocrino compuesto llamado gl....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Figura 1: Esquema general de protocolos. Dos métodos de disección distintos son aplicables a las larvas y a las hembras adultas, dependiendo del propósito de los experimentos. Los métodos de montaje también se diseñan de acuerdo con las condiciones de la muestra. Las técnicas de fijación, tinción e imagen son básicamente comunes a todas las muestras.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Recolección de huevos | |||
| placa de cultivo de tejidos (55 mm) | COMO UNO SOLO | Llame al 1-8549-02 | para placas de agar zumo de uva |
| Vaso de recogida | HIKARI KAGAKU | ||
| pasta de levadura | Levadura seca oriental, Tokio | ||
| 100% zumo de uva | Welch Alimentos Inc. | ||
| Cría de larvas | |||
| viales pequeños (12 ml, 40×23,5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| Lazo desechable | COMO UNO SOLO | 6-488-01 | |
| Alimento estándar para moscas | La receta está en el sitio web del centro de stock de Bloomington. | ||
| disección | |||
| microscopio de disección | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| microscopio de disección | Leica | S8 AP0 | |
| Placa de cultivo de tejidos (35 x 10 mm, sin tratar) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | Silicona coarting dentro de platos | |
| Aguja Terumo (27G, 0,40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | Un "cuchillo" para cortar el tejido |
| pinzas, Inox, #5 | Dumont, Suiza | ||
| Espiga para insectos (0,18 mm de diámetro) | Marca Shiga | para la disección de filetes | |
| Micro tijeras | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fijación | |||
| Agua ultrapura | Merck Millipore | ||
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | |||
| Formaldehído | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehido | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Tritón-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Microtubos (1,5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubación | |||
| Como un mezclador giratorio TM-300 (balancín) | Al unísono | TM-300 | rockero |
| Albúmina sérica bovina | sigma | 9048-46-8 | |
| Anticuerpo primario | |||
| anti-Sro (conejillo de indias), 1:1000 | |||
| anti-GFP (conejo), 1:1000 | Sondas moleculares | A6455 | Shimada-Niwa y Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mAb de ratón, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (conejo), 1:500 | sigma | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (ratón) | Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherina (rata), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| Anti-NC82 (ratón), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| Anticuerpo secundario | |||
| Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, conjugado Alexa Fluor 488 | Tecnologías de la Vida | A-11008 | |
| Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Alexa Fluor 488 | Tecnologías de la Vida | A-11001 | |
| Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-rata de cabra, conjugado Alexa Fluor 546 | Tecnologías de la Vida | A-11081 | |
| Anticuerpo secundario anti-cobaya IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 555 | Tecnologías de la Vida | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 faloidina conjugada con colorante | Tecnologías de la Vida | A-22283 | |
| Reactivos de montaje | |||
| Vidrio micro deslizante | Matsunami Vidrio Ind., Ltd. | SS7213 | |
| Cubreobjetos cuadrados para microscopio | Matsunami Vidrio Ind., Ltd. | C218181 | |
| Reactivo FluorSave (reactivo de montaje) | Calbiochem | 345789 | |
| Pipeta de transferencia 1 ml (Gotero desechable) | Watson | 5660-222-1S | |
| Acciones de mosca | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | del Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | regalos de K. Ito, Universidad de Tokio. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) y Alekseyenko, O. V, Lee, C. y Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | del Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | del Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
