Disección de glándulas anulares larvariales: aislamiento de órganos endocrinos en desarrollo de Drosophila

Resumen

Fuente: Imura, E., et al. Protocolos para la visualización de órganos esteroidogénicos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe la glándula anular de Drosophila, una compleja estructura endocrina importante para la biosíntesis y secreción de ecdisteroides y otras hormonas. El protocolo presentado demuestra su disección, fijación e inmunotinción.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Imura et al., Protocolos para la visualización de órganos esteroidogénicos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: El esquema general de los protocolos se muestra en Figura 1.

1. La disección de la glándula anular larvaria (RG)

NOTA: En D. melanogaster, que pertenece a cyclorrhaphous Diptera, el PG se encuentra dentro de un órgano endocrino compuesto llamado glándula anular (RG, Figura 2D). Dado que es inviable que la PG se separe quirúrgicamente de otros tipos de células (discutida más adelante), un objetivo práctico es aislar una RG intacta y no dañada por disección.

1. Preparación de larvas en las etapas de desarrollo adecuadas
   NOTA: Para sincronizar las etapas de desarrollo de las larvas de D. melanogaster, es necesario recolectar los huevos dentro de un período de tiempo estrecho y recolectar las larvas en los momentos apropiados.
   1. Recoja los huevos durante 2 h en una placa de agar jugo de uva a 25 ° C.
   2. Recoja las larvas recién eclosionadas del 1er estadio bajo un microscopio de disección con pinzas y transfiérelas a un pequeño frasco que contenga puré de levadura estándar / harina de maíz alimento para moscas.
      NOTA: La edad de las larvas se representa por "horas después de la puesta de huevos (hAEL)", "horas después de la eclosión (hAH)" u "horas después de la ecdisis L3 (hAL3E)".
   3. En el momento adecuado, recoja las larvas en etapa con un lazo de plástico desechable para evitar lesiones indeseables. Para minimizar una diferencia en la progresión del desarrollo de las larvas del^3º estadio, recoja las larvas del^2º estadio a 70 hAEL (48 hAH) y permita que muden en intervalos de 2 h. A continuación, recoja las larvas del^3er estadio dentro de las 2 h posteriores a la ecdisis L3; este procedimiento da 0-2 larvas hAL3E.
   4. Transfiera las larvas en etapas a un plato lleno de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   5. Enjuague las larvas con PBS para eliminar los restos de comida del cuerpo.
2. Disección gruesa de larvas bajo un microscopio de disección
   1. Sostenga el gancho de la boca de una larva con pinzas. Corte el cuerpo de la larva en el tercio anterior de la longitud del cuerpo con microtijeras.
   2. Sostenga el extremo cortado del cuerpo larvario anterior con un par de pinzas. Con el otro par de pinzas, empuje suavemente la punta de la cabeza hacia el interior del cuerpo; Este procedimiento da la vuelta al cuerpo de la larva.
      NOTA: Este paso se puede omitir para la disección de las larvas del^1er estadio.
   3. Repita los pasos 1.2.1-1.2.2 con larvas adicionales durante 5-10 min.
      NOTA: El número de larvas debe ser igual o inferior a 20 para ahorrar tiempo en la disección.
3. Fijación y tinción de tejido con inmunohistoquímica
   1. Coloque el tercio anterior de los cuerpos larvarios (paso 1.2.2) en un microtubo de 1,5 mL lleno de 500 μL de solución fija (4% de paraformaldehído en PBS). Fije menos de 20 muestras a la vez, de lo contrario, el PBS adjunto a las muestras fijadas puede causar una dilución desfavorable del fijador. Para la disección de filetes, retire una gota de PBS y luego agregue una gota de solución fija.
      NOTA: Para la solución fija, se puede usar formaldehído al 3,7% o paraformaldehído al 4%.
   2. Incubar los tejidos disecados en la solución fija durante 30 min a temperatura ambiente (RT) o, alternativamente, durante 2 h a 4 °C.
   3. Reemplace la solución fija con 500 μL de PBS y enjuague rápidamente las muestras 3 veces. Lave las muestras con 500 μL de PBT al 0,3% (PBS + etoxilato de octilfenol al 0,3%) durante 15 min en un balancín a RT. Para la disección de filetes, retire los alfileres de insectos y transfiera las muestras a un microtubo de 1,5 ml.
      NOTA: Para aumentar la permeabilidad de los anticuerpos en los tejidos, las muestras se tratan con 500 μL 2,0% PBT durante 1-2 h en un balancín a RT.
   4. Reemplace el PBT con 500 μL de solución bloqueante (2% de albúmina sérica bovina en PBT). Incubar las muestras durante 1,5 h en un balancín a RT.
   5. Sustituya la solución de bloqueo por 50 μL de la solución de anticuerpos primarios, es decir, anticuerpos diluidos en la solución de bloqueo.
   6. Incubar las muestras durante la noche en un balancín a 4 °C.
   7. Reemplace la solución de anticuerpos primarios con 500 μL de PBT al 0,3% y enjuague rápidamente las muestras 5 veces. Lave las muestras 3 veces con 500 μL de PBT al 0,3% durante 15 minutos cada una en un balancín a RT.
   8. Reemplace el PBT al 0,3% con 50 μL de la solución de anticuerpos secundarios (anticuerpos conjugados con colorante diluidos en la solución de bloqueo). Para la tinción nuclear, se añaden 0,5 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0,1 mg/ml de solución madre) a 50 μL de solución. Incubar las muestras en un balancín durante 2 h a RT o, alternativamente, a 4 °C durante la noche.
      NOTA: Mantenga las muestras en la oscuridad.
   9. Reemplace la solución de anticuerpos con 500 μL de PBT al 0,3% y enjuague 5 veces. Lave las muestras 3 veces con 500 μL de PBT al 0,3% durante 15 minutos cada una a RT.
4. Disección fina del complejo cerebro-RG que contiene la PG y el montaje
   1. Utilice una pipeta desechable para transferir las muestras inmunoteñidas a una placa llena de PBT al 0,3 %
      NOTA: Para evitar burbujas incómodas durante la disección y el montaje, se puede reemplazar el PBT al 0,3% con PBS.
   2. Bajo un microscopio de disección, sostenga la cutícula o el gancho bucal con un par de pinzas. Usando una aguja de 27 G conectada a una jeringa de 1 mL como un "cuchillo", corte la punta anterior del esófago y los discos oculares para eliminar el complejo cerebro-RG-disco ocular de la cutícula corporal.
   3. Separe el esófago y el intestino del complejo cerebro-RG-disco ocular con fórceps. Dado que el esófago pasa a través del cerebro por encima del cordón nervioso ventral (VNC), extraiga el intestino hacia el lado posterior.
      NOTA: Para extraer los discos imaginales adicionales de las muestras, corte las conexiones entre el cerebro, los discos oculares y los discos de las piernas con un cuchillo de aguja.
   4. Repita los pasos 1.4.1-1.4.4 para otras muestras.
      NOTA: Para evitar que los restos de tejido se adhieran a las muestras, transfiera cada muestra completa a un plato limpio diferente lleno de PBT o PBS al 0,3%.
   5. Transfiera las muestras al centro de un portaobjetos de vidrio limpio con una micropipeta.
      NOTA: En el caso de las larvas de^2º o^3º estadio, el extremo de la punta de una micropipeta debe truncarse con una cuchilla de afeitar.
   6. Bajo un microscopio de disección, alinee las muestras individuales con su lado dorsal hacia arriba usando fórceps.
      NOTA: El RG se encuentra en el lado dorsal del cerebro (Figura 2A). Esta alineación facilita la especificación de muestras individuales durante la obtención de imágenes.
   7. Incline un portaobjetos de vidrio y limpie la mayor cantidad posible de exceso de PBT. Coloque una gota de reactivo de montaje en un lado del portaobjetos. Coloque el borde de un cubreobjetos desde el otro lado de la gota y coloque el cubreobjetos sobre las muestras lentamente con pinzas.
      NOTA: Este procedimiento evita que las muestras se muevan fuera del cubreobjetos.
   8. Almacene las muestras a 4 °C. Manténgalas en la oscuridad.

Resultados

Figura 1: Esquema general de protocolos. Dos métodos de disección distintos son aplicables a las larvas y a las hembras adultas, dependiendo del propósito de los experimentos. Los métodos de montaje también se diseñan de acuerdo con las condiciones de la muestra. Las técnicas de fijación, tinción e imagen son básicamente comunes a todas las muestras.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Recolección de huevos
placa de cultivo de tejidos (55 mm)	COMO UNO SOLO	Llame al 1-8549-02	para placas de agar zumo de uva
Vaso de recogida	HIKARI KAGAKU
pasta de levadura	Levadura seca oriental, Tokio
100% zumo de uva	Welch Alimentos Inc.
Cría de larvas
viales pequeños (12 ml, 40×23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
Lazo desechable	COMO UNO SOLO	6-488-01
Alimento estándar para moscas			La receta está en el sitio web del centro de stock de Bloomington.
disección
microscopio de disección	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
microscopio de disección	Leica	S8 AP0
Placa de cultivo de tejidos (35 x 10 mm, sin tratar)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		Silicona coarting dentro de platos
Aguja Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Un "cuchillo" para cortar el tejido
pinzas, Inox, #5	Dumont, Suiza
Espiga para insectos (0,18 mm de diámetro)	Marca Shiga		para la disección de filetes
Micro tijeras	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
fijación
Agua ultrapura	Merck Millipore
solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Formaldehído	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehido	Nacalai tesque	02890-45
Tritón-X100	Nacalai tesque	35501-15
Microtubos (1,5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubación
Como un mezclador giratorio TM-300 (balancín)	Al unísono	TM-300	rockero
Albúmina sérica bovina	sigma	9048-46-8
Anticuerpo primario
anti-Sro (conejillo de indias), 1:1000
anti-GFP (conejo), 1:1000	Sondas moleculares	A6455	Shimada-Niwa y Niwa, 2014
anti-GFP (mAb de ratón, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (conejo), 1:500	sigma	S5545
anti-Hts 1B1 (ratón)	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherina (rata), 1:20	DSHB	DCAD2
Anti-NC82 (ratón), 1:50	DSHB	nc82
Anticuerpo secundario
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, conjugado Alexa Fluor 488	Tecnologías de la Vida	A-11008
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Alexa Fluor 488	Tecnologías de la Vida	A-11001
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-rata de cabra, conjugado Alexa Fluor 546	Tecnologías de la Vida	A-11081
Anticuerpo secundario anti-cobaya IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 555	Tecnologías de la Vida	A-21435
Alexa Fluor 546 faloidina conjugada con colorante	Tecnologías de la Vida	A-22283
Reactivos de montaje
Vidrio micro deslizante	Matsunami Vidrio Ind., Ltd.	SS7213
Cubreobjetos cuadrados para microscopio	Matsunami Vidrio Ind., Ltd.	C218181
Reactivo FluorSave (reactivo de montaje)	Calbiochem	345789
Pipeta de transferencia 1 ml (Gotero desechable)	Watson	5660-222-1S
Acciones de mosca
w; GMR45C06-GAL4			del Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			regalos de K. Ito, Universidad de Tokio.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) y Alekseyenko, O. V, Lee, C. y Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			del Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			del Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)