Este protocolo es un extracto de Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).
1. Ensayo de sonda de calor local
Suministramos un estímulo térmico nocivo a un segmento individual del cuerpo de las larvas utilizando una sonda térmica hecha a medida y fabricada por Pro-Dev Engineering (ver Tabla de materiales). Aunque esta sonda tiene características de diseño óptimas (una pequeña punta metálica de ~ 0,07mm2 de área y la capacidad de mantener con precisión una temperatura de punto de ajuste de 23 °C a 65 °C), en principio cualquier herramienta con una punta pequeña que se pueda calentar a una temperatura definida durante un período de hasta 20 segundos debería ser suficiente. La punta de la sonda se utiliza para estimular las larvas tempranas del3er estadio precisamente en la línea media dorsal en el segmento abdominal A4 (ver Figura 1). En respuesta a este estímulo térmico, las larvas generalmente exhibirán un comportamiento de retirada aversivo de rodar lateralmente 360 grados o más. Este comportamiento es distinto de su respuesta de tacto ligero a una sonda metálica no nociva a temperatura ambiente, que generalmente implica una breve pausa en su actividad locomotora.
Protocolo para el ensayo de la sonda de calor:
- Temperatura preestablecida de la sonda térmica hasta el punto de ajuste deseado.
- Use un pincel o pinzas para transferir suavemente una larva individual a una plataforma plana (generalmente usamos un pequeño trozo de vinilo cortado de un aglutinante) en el que las larvas serán estimuladas posteriormente. La larva debe estar cubierta por una fina película de agua antes de entrar en contacto con la sonda térmica. La película de agua que cubre la larva debe ser lo menos posible y cubrir completamente la larva, al tiempo que se asegura de que la larva no se seque al tocar el vinilo.
- Presione suavemente la punta de la sonda contra la larva en el segmento A4 aplicando una ligera presión con la punta en un ángulo de aproximadamente 45° entre la sonda y la superficie de la larva (ver Figura 1). La presión debe causar una ligera hendidura en la superficie de la larva y, por lo general, será suficiente para evitar la locomoción. Si la larva continúa moviéndose, aplique un poco más de presión y, por lo general, se detendrá. No registre datos de larvas que se muevan más allá del campo de visión o para las cuales no se pueda lograr un contacto constante con la sonda hasta la respuesta o el corte de 20 s.
- Continúe estimulando a la larva hasta que se muestre una respuesta de retirada o hasta que se alcance el límite de 20 segundos, lo que ocurra primero. Las larvas que responden suelen mostrar primero un comportamiento preliminar de levantar la cabeza y la cola. A esto le suele seguir el comportamiento de retirada de rodar al menos 360 grados. Solo un giro completo de 360 grados se califica como comportamiento nocifensivo (la elevación preliminar de la cabeza o la cola no lo es).
- Una vez que se inicia el comportamiento de retirada, libere el contacto con la sonda y registre la latencia o el tiempo hasta la retirada. Si no se observa ningún comportamiento de retirada en 20 segundos, entonces la larva no responde. Los respondedores se pueden dividir a su vez en 2 categorías. Si el comportamiento de retirada se muestra dentro de los 5 segundos, entonces la larva responde rápidamente. Si el comportamiento de retirada se muestra entre 5 y 20 segundos, entonces la larva responde lentamente (ver Figura 1 en Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
