Este protocolo es un extracto de Liu et al. Un ensayo de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de las larvas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2018).
1. Configuración del gradiente de temperatura
- Preparación de gradiente unidireccional
- Para crear un ambiente húmedo durante los ensayos, coloque los dos bloques de aluminio conectados a dos baños de agua sobre toallas de papel húmedas, separadas por 10 cm (Figura 1A).
- Encienda los dos baños de agua ~ 2 h antes de iniciar el ensayo para permitir suficiente tiempo para que la temperatura de los bloques de aluminio se equilibre><.
NOTA: Se recomienda realizar un experimento simulado para determinar la temperatura de cada baño de agua que se necesita para lograr el gradiente de temperatura lineal deseado. En la Tabla 1 se enumeran algunos pares de temperatura típicos para configurar los baños de agua. Sin embargo, tenga en cuenta que las temperaturas de la superficie se ven afectadas por la temperatura ambiente. La longitud de la tubería también afecta las temperaturas, ya que hay enfriamiento en los tubos. La longitud de la tubería en nuestra configuración es de 1,5 m.
- Calentar en el microondas 100 mL de agarosa al 1% en el ajuste de alta potencia en un frasco redondo de boca ancha de 500 mL y verter 25 mL/placa de ensayo en una mesa de trabajo nivelada. Prepare dos placas de ensayo, que se pueden colocar en los bloques de aluminio al mismo tiempo (Figura 1A).
- Después de que la agarosa se haya solidificado (10-20 min), frote suavemente cada superficie de agarosa con una esponja de cocina estándar o una esponja de melamina para que la superficie de agarosa sea ligeramente gruesa, de modo que al rociar agua sobre el gel de agarosa, se cree una membrana de agua fina y lisa y no se formen gotas de agua.
- Sumerja completamente las placas en un recipiente con agua destilada hasta que el ensayo esté listo para realizarse para evitar que las placas se sequen.
- Preparar un degradado bidireccional (opcional)
- Para crear un ambiente húmedo durante los ensayos, coloque tres bloques de aluminio a 8 cm de distancia (Figura 1B) sobre toallas de papel húmedas.
- Encienda los dos baños de agua ~ 2 h antes de iniciar el ensayo para permitir suficiente tiempo para que la temperatura de los bloques de aluminio se equilibre><.
NOTA: Se recomienda realizar un experimento simulado para determinar la temperatura de cada baño de agua para el gradiente bidireccional. En la Tabla 2 se enumeran algunos pares de temperatura típicos para configurar los baños de agua. Sin embargo, tenga en cuenta que las temperaturas de la superficie se ven afectadas por la temperatura ambiente. La longitud de la tubería también afecta las temperaturas, ya que hay enfriamiento en los tubos. La longitud de la tubería en nuestra configuración es de 1,5 m.
- Para evitar que la agarosa se derrame fuera de la placa, envuelva los bordes de la placa de aluminio con cinta adhesiva para formar una pared de 10 mm de altura (Figura 1B).
- Usando la configuración de alta potencia, cocine en el microondas 200 mL de agarosa al 1% en una botella redonda de boca ancha de 500 mL y vierta 120 mL en una placa de ensayo.
- Después de que la agarosa se haya solidificado (~ 30 min), frote suavemente cada superficie de agarosa con una esponja de cocina estándar o una esponja de melamina para hacer que la superficie de agarosa sea ligeramente gruesa, de modo que al rociar agua sobre el gel de agarosa, se cree una membrana de agua delgada y lisa y no se formen gotas de agua.
- Sumerja completamente las placas de ensayo en un recipiente con agua destilada hasta que el ensayo esté listo para realizarse para evitar que se sequen.
- Configurar degradado unidireccional
- Prepare los reactivos y los artículos en un banco junto al aparato de ensayo de gradiente (consulte la Tabla de materiales).
- Para promover una transferencia de temperatura eficiente, llene los espacios entre los bloques de aluminio y las placas de ensayo rociando agua en la interfaz entre los bloques y la placa.
- Con guantes, retire las placas de ensayo del recipiente de agua. Si el agua invade entre el gel de agarosa y la placa y provoca la formación de protuberancias en la superficie, retire el agua con una micropipeta P1000.
- Coloque las placas de ensayo en los bloques de aluminio de modo que las demarcaciones que están a 2 cm de cada borde coincidan exactamente con los bordes de los bloques de aluminio (Figura 1A,C).
- Rocíe agua sobre la superficie de la placa (una membrana de agua delgada que cubra la superficie de agarosa es suficiente) para evitar que el gel de agarosa se seque. Asegúrese de que la membrana de agua sea continua y esté libre de gotas de agua, ya que las larvas pueden quedar atrapadas en las gotas de agua.
- Cubra el sistema de degradado con una caja de cartón para reducir la evaporación del agua y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere de 5 a 10 minutos para permitir que la temperatura se equilibre.
- Compruebe la temperatura de la superficie en 12 puntos de la placa (Figura 1C). Tome dos mediciones dentro de cada zona para establecer si hay o no variabilidad dentro de una zona. Asegúrese de que la temperatura en ambos puntos esté dentro de ± 0,2 °C de la temperatura deseada.
NOTA: La variabilidad dentro de una zona generalmente ocurre porque las distancias exactas de los dos puntos al borde de los bloques de aluminio no son idénticas. Ajuste la posición de la placa en los bloques de aluminio para asegurarse de que las demarcaciones que están a 2 cm de cada borde coincidan exactamente con los bordes de los bloques de aluminio.
- Si el gradiente de temperatura medido se desvía del gradiente deseado, aumente o disminuya los ajustes de temperatura del baño de agua y vuelva a verificar la temperatura de la superficie después de que la temperatura del baño de agua se estabilice.
- Cubra el sistema de gradiente con una caja de cartón hasta comenzar el ensayo.
- Configurar gradiente bidireccional (opcional)
- Prepare los reactivos y los artículos en un banco junto al aparato de ensayo de gradiente (consulte la Tabla de materiales).
- Rocíe agua sobre las superficies de los tres bloques de aluminio para promover una transferencia de temperatura eficiente desde los bloques de aluminio a las placas de ensayo llenando cualquier espacio entre las superficies.
- Retire con cuidado las placas de ensayo del recipiente de agua y colóquelas sobre los bloques de aluminio. Si el agua invade entre el gel de agarosa y la placa, lo que puede provocar la formación de protuberancias en la superficie, retire el agua con una micropipeta P1000.
- Coloque la placa de ensayo en los bloques de aluminio de modo que las líneas medias de la primera y la última zona de cualquiera de los bordes coincidan exactamente con los bordes de los dos bloques de aluminio laterales (Figura 1B,D).
- Rocíe agua sobre la superficie de la placa (una membrana de agua delgada que cubra la superficie de agarosa es suficiente) para evitar que el gel de agarosa se seque. Asegúrese de que la membrana de agua sea continua y esté libre de gotas de agua, ya que las larvas pueden quedar atrapadas en las gotas de agua.
- Cubra el sistema de degradado con una caja de cartón para reducir la evaporación del agua y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere de 5 a 10 minutos para permitir que la temperatura se equilibre.
- Verifique la temperatura de la superficie en dos puntos a lo largo de la línea media de cada una de las 10 zonas (Figura 1D). Tome dos mediciones dentro de cada zona para establecer si hay o no variabilidad dentro de una zona. Asegúrese de que la temperatura en ambos puntos esté dentro de ± 0,2 °C de la temperatura deseada.
NOTA: La variabilidad dentro de una zona generalmente ocurre porque las distancias exactas de los dos puntos al borde de los bloques de aluminio no son idénticas. Ajuste la posición de la placa en los bloques de aluminio para asegurarse de que las líneas medias de la primera y la última zona más cercanas a cada borde coincidan exactamente con los bordes de los dos bloques de aluminio laterales.
- Si el gradiente de temperatura medido se desvía del gradiente deseado, ajuste los ajustes de temperatura del baño de agua y vuelva a verificar la temperatura de la superficie después de que la temperatura del baño de agua se estabilice.
- Cubra los bloques con una caja de cartón hasta el inicio del ensayo.
2. Ensayo y cálculo
- Retire la caja de cartón y verifique la temperatura de la superficie del gel inmediatamente antes de transferir las larvas a la placa. Minimice el tiempo que la caja de cartón está abierta para evitar interrumpir el equilibrio de temperatura. Si la superficie está seca, rocíe una pequeña cantidad de agua sobre la superficie.
- Distribuya 150 ± 50 larvas cerca del centro de cada placa (entre las zonas 3 y 4 de las 6 zonas) para el gradiente unidireccional (zona de liberación; Figura 1C).
NOTA: Para el gradiente bidireccional, distribuya de 200 a 400 larvas a lo largo de la zona media de cada mitad (Figura 1D).
- Coloque una tapa de microplaca sobre cada placa de ensayo para evitar que las larvas se arrastren hacia afuera. Cubra la instalación con una caja de cartón para evitar la exposición a la luz, que podría afectar la elección de larvas en el gel de agarosa.
NOTA: Para el gradiente bidireccional, no debería ser necesario cubrir la placa con una tapa, porque la placa es más grande y la temperatura preferida de las larvas está en la zona media. En consecuencia, pocas larvas se acumulan en los bordes y tienen la oportunidad de arrastrarse.
- Deje que el ensayo continúe durante 10-30 min para el gradiente unidireccional, y durante 15-35 min para el gradiente bidireccional, dependiendo de la edad de las larvas (Tabla 3).
- Retire la caja de cartón y la tapa de la microplaca. Fotografía las placas desde arriba con una cámara digital. Tome dos fotografías de cada placa de ensayo para que el investigador pueda elegir la que tenga mejor contraste y brillo para el análisis.
- Retire todas las larvas de las placas de ensayo y de cualquier lugar fuera de las placas por aspiración.
- Limpie a fondo las placas de ensayo, los tubos y el filtro de células con agua destilada. Reutilice las placas de ensayo preparadas ese día a menos que la superficie de la agarosa esté dañada.
- Calcular el porcentaje de distribución de las larvas en cada zona.
- Abra la imagen fotográfica de los resultados del ensayo utilizando cualquier software que permita agregar marcas a la imagen. Para indicar las zonas de ensayo, dibuje líneas verticales cada 2 cm en función de las demarcaciones de la placa de ensayo.
- Cuente el número de larvas en cada zona y registre los números. No cuente las larvas en regiones a 0,5 cm de cualquiera de las paredes. El gel es más espeso cerca de las paredes y las temperaturas de la superficie no son lineales en estas regiones.
- Para el gradiente unidireccional, calcule la distribución porcentual en cada zona de la siguiente manera:
(número de larvas en una zona dada de 2 cm)/ (número total de larvas en 6 zonas) x 100.
- Para el gradiente bidireccional, calcule la distribución porcentual en cada zona de la siguiente manera:
(número de larvas en una zona dada de 2 cm)/ (número total de larvas en 5 zonas a cada lado del gradiente) x 100.
