Este protocolo es un extracto de Chiu et al., Ensayando la actividad locomotora para estudiar los ritmos circadianos y los parámetros del sueño en Drosophila, J. Vis. Exp.(2010).
1. Carga de moscas en tubos de actividad y sistema de monitoreo de actividad locomotora
- Antes de cargar las moscas en los tubos de actividad, encienda las incubadoras que se utilizarán para albergar los monitores de actividad. Ajuste la temperatura usando los controles de la incubadora y establezca el régimen de luz / oscuridad usando el controlador de luz del sistema DAM O el propio sistema de control de luz de la incubadora de acuerdo con el diseño experimental deseado. El tiempo necesario para cargar las moscas en los tubos de actividad debe ser suficiente para que la temperatura se estabilice.
- Anestesia a las moscas con dióxido de carbono.
- Use un pincel fino para transferir suavemente una sola mosca a un tubo de actividad.
- Agarre el centro de una sola pieza de hilo de alrededor de media pulgada con pinzas finas e inserte el hilo en el extremo no alimentario del tubo de actividad para tapar la abertura y evitar que la mosca escape durante el experimento, mientras que al mismo tiempo permite el flujo de aire hacia el tubo. Alternativamente, se pueden usar tapas de plástico con pequeños orificios (Trikinetics, Inc.) para cerrar la abertura.
- Asegúrese de que los tubos estén colocados de lado hasta que la mosca se despierte, o de lo contrario existe el riesgo de que la mosca se pegue a la comida.
- Inserte los tubos en los monitores de actividad. Con el modelo más nuevo y compacto de los monitores Trikinetics (Trikinetics DAM2 y DAM2-7), es necesario sujetar los tubos en su lugar con bandas elásticas para garantizar que el haz infrarrojo pase el tubo en la posición central.
- Coloque los monitores de actividad en las incubadoras y conéctelos al sistema de recopilación de datos a través de los cables telefónicos. Verifique con el software de recopilación del sistema DAM para asegurarse de que todos los monitores estén conectados correctamente y que se estén recopilando datos de cada uno de ellos. El monitor emite un haz de luz infrarroja a través del centro de cada tubo de actividad de vidrio. La actividad locomotora de las moscas se registra como datos binarios brutos donde se registra "uno" cada vez que se rompe el haz infrarrojo o se registra un "cero" en el que no se rompe el haz infrarrojo.
2. Diseño experimental para registrar datos para la determinación de la periodicidad y amplitud circadiana
- Las moscas se sincronizan y arrastran exponiéndolas al régimen de luz/oscuridad (LD) y temperatura deseado durante 2-5 días completos. La condición de arrastre más utilizada es un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad (12:12 LD) a 25 °C. Esta condición estándar generalmente aceptada se basa esencialmente en la idea de que Drosophila se originó en lugares afroecuatoriales. Al estudiar los ritmos circadianos, hay cierta fraseología con la que uno debe familiarizarse. Relevante para este protocolo, el tiempo en que se encienden las luces en la incubadora se define como zeitgeber time 0 (ZT0) y todos los demás tiempos son relativos a ese valor (por ejemplo, en un ciclo LD 12:12, ZT12 es el tiempo en que se apagan las luces). En condiciones estándar de LD 12:12, Drosophila melanogaster de tipo salvaje suele exhibir dos episodios de actividad; uno centrado alrededor de ZT0 denominado pico "matutino" y otro alrededor de ZT12 denominado pico "vespertino" (Figura 1A). Los episodios matutinos y vespertinos están controlados por el reloj endógeno, pero también hay respuestas de "sobresalto", que son ráfagas transitorias de actividad en respuesta a las transiciones de luz y oscuridad. Dos días de arrastre es el mínimo y podría utilizarse, por ejemplo, en pantallas grandes que requieren más tiempo y están orientadas a medir los períodos de funcionamiento libre en oscuridad constante (ver más abajo, paso 2). Sin embargo, si está interesado en estudiar los patrones de actividad durante un ciclo diario de luz-oscuridad, es preferible mantener las moscas durante 4-5 días en LD para obtener más datos. Esencialmente, el aumento del número de moscas o el número de días de LD en el análisis final de los datos (por ejemplo, los datos del conjunto de los últimos dos días de actividad locomotora de LD) generará perfiles y mediciones de actividad diurna más confiables (por ejemplo, el momento del pico matutino o vespertino). Además, la distribución diaria de la actividad varía en función de la duración del día (fotoperiodo) y de la temperatura. Una razón importante para alterar el fotoperiodo o la temperatura del estándar es si se quisiera estudiar cómo los patrones de actividad diaria experimentan una adaptación estacional (por ejemplo, Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila también puede ser arrastrada a ciclos de temperatura diarios (por ejemplo, Glaser y Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Los ciclos de temperatura que varían solo en 2-3 °C son suficientes para mantener los ritmos de actividad.
- Los ritmos de actividad locomotora de carrera libre se miden en condiciones constantes de oscuridad y temperatura una vez finalizado el período de arrastre (ver arriba, paso 1). La configuración del ciclo de luz se puede cambiar en cualquier momento en la fase oscura en el último día de LD, de modo que el día siguiente del experimento represente el primer día de DD. Siete días de recopilación de datos de DD son suficientes para calcular el período circadiano y la amplitud (por ejemplo, potencia o fuerza del ritmo) de las moscas. En general, es necesario un tamaño de muestra de al menos 16 moscas para obtener períodos confiables de funcionamiento libre para un genotipo en particular. Incluso si solo se está interesado en medir la actividad diurna, es mejor medir los períodos de carrera libre de las moscas en DD, ya que los cambios en el período endógeno pueden alterar la distribución diaria de la actividad en LD. Por ejemplo, las moscas con largos períodos endógenos suelen presentar picos vespertinos retrasados en la LD (p. ej., véase Figura 2).
- Al final del experimento, los datos binarios brutos recopilados con el software del sistema DAM se descargan en un dispositivo de almacenamiento de datos portátil, por ejemplo, una llave USB.
- Los datos binarios sin procesar se procesan utilizando DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) y se suman en intervalos de 15 y 30 minutos cuando se analizan los parámetros circadianos, o en intervalos de 1 a 5 minutos cuando se analizan los parámetros de sueño/descanso. Actualmente, cinco minutos contiguos de inactividad es la definición estándar de sueño/descanso en Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho y Sehgal, Methods Enzymol., (2005)).
- Hay muchas formas diferentes de analizar los datos recopilados en el sistema DAM, pero solo proporcionaremos los métodos que se utilizan habitualmente en nuestro laboratorio. Se utiliza Microsoft Excel para asignar el genotipo a diferentes grupos de muestras. Software FaasX (M. Boudinot y F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francia) o Insomniac (programa basado en Matlab; Leslie Ashmore, Universidad de Pittsburgh, Pensilvania) se utilizan para examinar los parámetros circadianos (p. ej., período y potencia) o de sueño/descanso (p. ej., porcentaje de sueño, duración media del período de reposo) respectivamente.
