$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo es un extracto de de Vries y Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Generar moscas de canalrodopsina
- Cross UAS-ChR2 vuela con el controlador Gal4 de su elección, usamos G105-Gal4, que se expresa en las neuronas Foma-1 en el lóbulo óptico.
- Para eliminar la posibilidad de una respuesta visual a la estimulación de la luz azul, ambas líneas de mosca están en un fondo w + norpA.
- Resultado final: w+norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Después de que las moscas adultas se acerquen, coloque a las hembras seleccionadas en alimentos frescos, suplementados con 10 μM all-trans-retinal (un cofactor requerido para ChR2) y protegidos de la luz, durante 3 días antes de realizar el ensayo de comportamiento.
2. Prepara 10 μM de alimento mejorado para todo lo trans-retinal
- Disuelva 100 mg de all-trans-retinal en 17,6 ml de etanol al 95% para producir 20 mM de retinal. Mantenga todo el retinal protegido de la luz en todo momento.
- Derrita la comida estándar de moscas de harina de maíz en el microondas y deje enfriar hasta que esté tibia al tacto.
- Mezclar 50 μl de 20 mM all-trans-retinal en viales de 10 ml de alimento para moscas.
- Deje que los viales se enfríen y manténgalos protegidos de la luz.
3. Equipamiento
- Puntas de pipeta: Las puntas de pipeta estándar de 1.000 μl se cortan cerca de la punta, creando un diámetro de poro de ~2,25 mm.
- Plataforma (ver Figura 1).
- Se construyó una base de Delrin, de 17 cm x 25 cm, con orificios roscados en cada esquina para adaptarse a conectores de manguera de refrigerante NPT de 1/4".
- Un soporte vertical, hecho de Delrin, está unido al centro de la base. Las dimensiones totales son 25 mm X 40 mm X 65 mm (ancho X fondo X alto). Una ranura de 10 mm de ancho recorre la longitud del soporte, con un tornillo de mariposa en la parte inferior. En la parte superior del soporte se fija una plataforma, de 25 mm X 40 mm X 10 mm, con un orificio de 3,5 mm de diámetro alineado con la ranura del soporte.
- Matrices de LED (ver Figura 1).
- Cuatro brazos de manguera de refrigerante, de ~18 cm de largo, se fijan a la base de la plataforma mediante el conector de la manguera de refrigerante. La manguera de refrigerante se usa solo como soporte estructural y no se usa para fines de enfriamiento.
- Las ranuras correctamente espaciadas se cortan en la pieza final de la manguera de refrigerante de cada brazo para fijar un disipador de calor en el extremo de cada brazo.
- Un LED azul Rebel Tri-Stars se monta en cada disipador de calor mediante cinta adhesiva térmica precortada. A cada Tri-Star se le coloca una lente Carclo 18° Tri-Star.
- Los LED Tri-Stars están conectados a los controladores de CC BuckPuck y a una fuente de alimentación según lo especificado. Hemos organizado nuestra configuración con cada BuckPuck impulsando dos Tri-Stars en serie.
- La iluminación de los cuatro LED Tri-Stars a 700 mA produjo una irradiancia de 713 W/m2 en nuestra plataforma.
- Cámara: La cámara está montada en un pequeño trípode y enfocada en la parte superior de la plataforma.
4. Ensayo conductual
- Anestesiar brevemente las moscas en el hielo.
- Coloque las moscas individuales en las puntas de las pipetas, usando cinta adhesiva para cerrar ambos extremos de la punta.
- Una vez que las moscas se hayan despertado y estén explorando activamente la punta de la pipeta, retire la cinta y coloque una pipeta en la ranura en el soporte vertical. El tornillo de mariposa se utiliza para asegurar la punta de la pipeta en su lugar y para cerrar la parte inferior de la punta.
- A medida que la mosca explora la punta de la pipeta (normalmente de 30 a 60 segundos), inicie la grabación de la cámara justo antes de que la mosca emerja de la punta a la plataforma.
- Después de que la mosca haya emergido en la plataforma, espere de 1 a 2 segundos y encienda los LED azules. Use un temporizador para medir manualmente el tiempo hasta que la mosca inicie el vuelo.
