Este protocolo es un extracto de Vogler y Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).
1. Antes de empezar
- Solución de hemolinfa artificial (AH) recién preparada que contiene 108 mM de Na+, 5 mM de K+, 2 mM de Ca2+, 8 mM de MgCl2, 1 mM de NaH2PO4, 4 mM de NaHCO3, 10 mM de sacarosa, 5 mM de trehalosa, 5 mM de HEPES (pH 7,1, todos los reactivos de Sigma Chemicals). La sacarosa y la trehalosa deben agregarse al AH desde soluciones madre refrigeradas justo antes de su uso para evitar la contaminación bacteriana.
- Lleve la AH a temperatura ambiente y oxigene la solución burbujeando con aire durante al menos 15 minutos.
- Extraiga varios capilares finos (p. ej., capilares de vidrio, 100ul, VWR) necesarios para la eliminación de la grasa.
2. Corazón de Drosophila semi-intacto de la mosca adulta
- Las moscas Drosophila adultas se anestesian con Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) durante 2-5 minutos. Se debe tener cuidado de no dejar las moscas en el Fly Nap para exposiciones más largas. La exposición a corto plazo al frío también se puede utilizar para anestesiar a las moscas, pero no se recomienda elCO2 ya que tiene efectos más duraderos sobre la frecuencia cardíaca y la ritmicidad.
- Las moscas anestesiadas se colocan, con la dorsal hacia abajo, en una placa de Petri recubierta con una fina capa de vaselina. La cutícula hidrofóbica de las alas y el cuerpo se "adhiere" reversiblemente a la gelatina, pero la mosca se puede reposicionar si es necesario. Esto se vuelve especialmente importante durante las manipulaciones posteriores.
- Se realiza un corte inicial con un par de tijeras de resorte curvadas (Roboz # 5611). Las hojas de tijera se colocan debajo de las patas y se inclinan hacia la superficie dorsal del tórax cerca del cuello. La cabeza, el cordón nervioso ventral y las patas se extraen con un solo corte. A continuación, la preparación se sumerge en una solución de hemolinfa artificial (AH) oxigenada.
- Con unas tijeras de resorte, se extrae la punta posterior del abdomen (compuesta por los segmentos abdominales 7 y 8) con un solo corte. Esto proporciona acceso para hacer cortes laterales a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para cortar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal. A continuación, se retira el colgajo liberado de la cutícula abdominal ventral.
- En los pasos 3 y 4, las conexiones anterior y posterior del intestino se cortan, por lo que los órganos abdominales ahora se mantienen en su lugar solo por traqueolas. El intestino y otros órganos abdominales generalmente se pueden extirpar como una sola masa usando pinzas de joyero (Roboz, # 55) y tirones suaves. La extirpación de los órganos internos revela el tubo cardíaco latente aún unido a la cutícula dorsal rodeado de cuerpos grasos.
- Los cuerpos grasos son bastante opacos en el microscopio óptico, por lo que a menudo es necesario eliminar parte de esta grasa para ver el tubo cardíaco con claridad. Esto se logra mediante una técnica de liposucción que utiliza capilares de vidrio finamente extraídos. Los capilares se fabrican utilizando un extractor de pipetas estándar (por ejemplo, el extractor de pipetas Sutter P-97) y luego se insertan en un tubo de plástico (Tygon, 1/16") conectado a una fuente de vacío. Este sistema se utiliza para succionar el exceso de grasa alrededor del tubo cardíaco. La fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta, por lo que no se deben utilizar pipetas con puntas de más de 40 micras de diámetro. Se debe tener mucho cuidado para evitar tocar el corazón mismo y, debido a que la porción posterior del corazón es muy frágil, esa región debe evitarse por completo.
- El tubo cardíaco de Drosophila adulto ahora está expuesto y debería estar latiendo. Si es necesario, la cutícula y el corazón adherido se pueden reposicionar levantando suavemente la cutícula de la vaselina y apisonándola con cuidado, evitando nuevamente cualquier contacto con el tejido cardíaco. En este punto, la solución que baña la preparación debe reemplazarse con AHL fresco. Esta preparación debe dejarse equilibrar durante 20-30 minutos con oxigenación antes de cualquier manipulación. Si la preparación se va a mantener durante más de 60 minutos, debe perfundirse con AHL fresco.
