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Este protocolo es un extracto de Gou et al., Ensayo de alto rendimiento para examinar las preferencias de puesta de huevos de Drosophila melanogaster individual, J. Vis. Exp. (2016).
1. Construcción de la cámara, montaje, configuración del ensayo
- Pida a un taller mecánico que construya cámaras acrílicas para poner huevos (Figura 1A-D). El dibujo de ingeniería de las diferentes piezas se muestra en la Figura Suplementaria 1-3. Aquí también se pueden encontrar imágenes de alta resolución (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserte láminas de plástico en la pieza de carga (superior) de la cámara como se muestra en Figura 1C. Esto sirve como la superficie inferior mientras se cargan las moscas en las arenas individuales de puesta de huevos.
- Anestesia a las hembras en una almohadilla de CO2 y cárgalas individualmente en cada arena de puesta de huevos. Permita ~ 30 minutos para que las moscas se recuperen del CO2 y se aclimaten al nuevo entorno.
- Prepara los sustratos de agarosa.
- Para mayor comodidad, mantenga una botella prefabricada de agarosa derretida al 1% en un baño de agua a 55 °C.
- Añadir la cantidad deseada de solución madre de sacarosa (2 M) en un tubo cónico de 50 ml y mezclarlo con la cantidad adecuada de agarosa. Por ejemplo, para preparar el sustrato de sacarosa de 150 mM, coloque 750 μl de solución de sacarosa 2 M en el tubo y luego llene el tubo con agarosa hasta la marca de 10 ml.
- Prepare el sustrato simple de la misma manera, pero agregue agua destilada en lugar de una solución de sacarosa.
NOTA: La concentración final de agarosa en este protocolo es ligeramente inferior al 1%. En nuestra experiencia, la concentración exacta de agarosa no importa siempre que se controle para que esté dentro de ~ 0.9 - 1.1% y que los dos sustratos tengan la misma concentración de agarosa.
- Tome la pieza de sustrato (inferior) de la cámara y pipetee 1.000 μl de sustrato de agarosa en cada canal como se ve en Figura 1D.
- Deje que la agarosa se solidifique durante ~ 30 min.
- Una vez que los sustratos de agarosa y las moscas estén listos, ensamble las tres piezas de la cámara de puesta de huevos y luego saque las láminas de plástico.
- Coloque las cámaras en incubadoras de moscas.
NOTA: La duración de los experimentos de puesta de huevos puede variar dependiendo de las necesidades experimentales. Por lo general, ejecutamos el experimento O/N (14 - 16 horas). Además, no se observó un impacto significativo del momento circadiano en las preferencias de puesta de huevos.
- Anestesiar a las hembras inyectando CO2 en la cámara. Desmonte la cámara, deseche las moscas anestesiadas en la morgue de moscas (es decir, una lata de café vacía llena de aceite de maíz). Tome fotografías de los resultados para el mantenimiento de registros (consulte Figura 2).
- Cuente el número de huevos manualmente y calcule los índices de preferencia para el análisis. Calcule el índice de preferencia como (Na - Nb)/(Na + Nb) donde Na y Nb representan el número de huevos en el sitio a frente al sitio b, respectivamente.
