C. elegans Disección de blastómeros: un método para extraer la cáscara del huevo y disociar las células embrionarias

Resumen

Fuente: Hsu, C. R., et al. Reconstitución in vitro de patrones de contacto celular espacial con blastómeros embrionarios aislados de Caenorhabditis elegans y perlas adhesivas de poliestireno.J. Vis. Exp.(2019).

Este video presenta un método para aislar blastómeros de C. elegans de embriones tempranos. Las células resultantes son adecuadas para cultivos celulares o experimentos ex vivo.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Hsu et al, Reconstitución in vitro de patrones de contacto celular espacial con blastómeros embrionarios aislados de Caenorhabditis elegans y perlas adhesivas de poliestireno, J. Vis. Exp.(2019).

1. Aislamiento de blastómero embrionario
2. Use guantes y bata de laboratorio para evitar cortes y contacto con la solución blanqueadora.
   1. Sujete cada extremo de un microcapilar (capacidad; 10 μL) con la mano derecha e izquierda.
   2. Tire del microcapilar hacia ambos extremos para aplicar tensión y lleve el centro del capilar sobre un quemador para hacer dos capilares tirados a mano (Figura 1A).
   3. Recorte las puntas de los capilares extraídos a mano con pinzas bajo el microscopio de disección y conecte el capilar extraído a un aparato de pipeteo bucal. Prepara dos tipos de pipetas. Los tamaños de apertura de la punta de las pipetas deben ser aproximadamente 2 veces y 1 vez la longitud del eje corto de los embriones de C. elegans (30 μm) para la transferencia de embriones y la extracción de la cáscara del huevo, respectivamente (Figura 1B-D).
   4. Pipetear 45 μL de solución de sal de huevo en un pocillo de un portaobjetos de varios pocillos (Figura 2A; abajo).
   5. Coloque de 5 a 10 C. elegans adultos en un pozo que contenga una solución de sal de huevo.
   6. Para obtener embriones tempranos de C. elegans, corte los adultos en pedazos colocando dos agujas a la derecha y a la izquierda del cuerpo de C. elegans y deslizando las agujas una sobre la otra (Figura 2A; esquema superior).
   7. Pipetear 45 μL de solución de hipoclorito en un pocillo junto al pocillo que contiene la solución de sal de huevo (Figura 2B).
   8. Pipetear 45 μL del medio de crecimiento de Shelton en los tres pocillos subsiguientes junto al pocillo que contiene la solución de hipoclorito (Figura 2B).
   9. Transfiera embriones en etapa de 1 célula y embriones en etapa temprana de 2 células a la solución de hipoclorito mediante pipeteo bucal con el capilar extraído a mano para la transferencia de embriones (Figura 2B).
   10. Espere de 40 a 55 s.
   11. Lave los embriones transfiriéndolos de la solución de hipoclorito al medio de crecimiento de Shelton mediante pipeteo bucal con el capilar extraído a mano para la transferencia de embriones (Figura 2B).
   12. Lavar los embriones de nuevo transfiriéndolos a un nuevo pocillo del medio de crecimiento de Shelton mediante pipeteo bucal con el capilar extraído a mano para la transferencia de embriones (Figura 2B).
   13. Transfiera los embriones lavados a un nuevo pocillo del medio de crecimiento de Shelton mediante pipeteo bucal con el capilar extraído a mano para la transferencia de embriones. Usando el capilar dibujado a mano para la extracción de la cáscara del huevo, repita cuidadosamente el pipeteo (Figura 2C; esquema central). Si la cáscara del huevo se extrae con éxito, las células embrionarias se volverán más esféricas (Figura 2C; derecha).
   14. Separe los blastómeros embrionarios en etapa de 2 células mediante un pipeteo suave y continuo con el capilar extraído a mano para la extracción de la cáscara del huevo (Figura 2D).

Figura 1: Aislamiento de blastómeros.(A) Tracción manual de capilar de vidrio. (B) Capilar de vidrio dibujado a mano para la transferencia de embriones. (C) Capilar de vidrio dibujado a mano para la extracción de cáscara de huevo. (D) Esquemas que muestren el tamaño apropiado de la abertura capilar para la extracción de la cáscara de huevo. Las flechas indican embriones. Las barras de escala muestran 100 μm.

Figura 2: Flujo de trabajo de aislamiento de blastómeros.(A) Disección de C. elegans adultos en tampón de sal de huevo para obtener embriones. Las fotografías muestran embriones en etapa de 2 y 4 células antes de la extracción de la cáscara del huevo. (B) Tratamiento y lavado de hipoclorito. (C) Los esquemas muestran el momento apropiado para la extracción de la cáscara de huevo. La fotografía muestra un embrión en etapa de 4 células después de la extracción de la cáscara del huevo. D) Separación de blastómeros. La fotografía muestra un embrión separado en etapa de 2 células. Los tamaños de las flechas en C y D indican las fuerzas relativas requeridas durante el pipeteo. Las barras de escala muestran 50 μm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Conjunto de tubo aspirador	Drummond	21-180-13	Para el aislamiento de blastómeros.
Cepa de Caenorhabditis elegans: N2, tipo salvaje	Centro de Genética de Caenorhabditis	N2	Cepa utilizada en este estudio
Cepa de Caenorhabditis elegans: KSG5, genotipo: zuIs45; itIs37	En casa	KSG5	Cepa utilizada en este estudio
Mircopipets calibrados, 10 μL	Drummond	21-180-13	Para el aislamiento de blastómeros
CD Concentrado de Lípidos	Tecnologías de la Vida	11905031	Para el aislamiento de blastómeros. Trabajo en la campana de cultivo de tejidos.
Clorox	Clorox	N. A.	Para el aislamiento de blastómeros. Abra un frasco nuevo cuando el tratamiento con hipoclorito no funcione bien.
Soporte de cubreobjetos	En casa	N.D.	Para el aislamiento de blastómeros.
Microscopio de disección: Zeiss Stemi 508 con soporte M. La fuente de luz es LED incorporada. El aumento del ocular es de 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Para el aislamiento de blastómeros.
Suero bovino fetal, Qualified One Shot, origen Canadá	Gibco	A3160701	Para el aislamiento de blastómeros. Trabajo en la campana de cultivo de tejidos.
Agujas hipodérmicas de deslizamiento de precisión y uso general, calibre 25	Bd	14-826AA	Para el aislamiento de blastómeros
Inulina	Alfa Aesar	AAA1842509	Para el aislamiento de blastómeros
MEM Solución Vitamínica (100x)	Gibco	11120052	Para el aislamiento de blastómeros.
Portaobjetos multiprueba 10 pozos	MP Biomedicals	ICN6041805	Para el aislamiento de blastómeros
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140148	Para el aislamiento de blastómeros.
Polivinilpirrolidona	Biorreactivos de Fisher	BP431-100	Para el aislamiento de blastómeros
Cloruro de potasio	Biotienda	POC888	Para el aislamiento de blastómeros
Medio estéril de Drosophila de Schneider	Gibco	21720024	Para el aislamiento de blastómeros. Trabajo en la campana de cultivo de tejidos.
Cloruro de sodio	Biotienda	SOD001	Para el aislamiento de blastómeros
Solución de hidróxido de sodio, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	Para el aislamiento de blastómeros
Filtros de jeringa, PTFE, no estériles	Basix	13100115	Para el aislamiento de blastómeros.
Tygon S3 Tubo de Laboratorio,, Formulación E-3603, Diámetro interior 3.175 mm	Plásticos de alto rendimiento Saint Gobain	89403-862	Para el aislamiento de blastómeros.
Tygon S3 Tubo de laboratorio,, Formulación E-3603, Diámetro interior 6,35 mm	Plásticos de alto rendimiento Saint Gobain	89403-854	Para el aislamiento de blastómeros.