El siguiente protocolo es un extracto de Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).
- Preparación de Organismos Experimentales
- Escoja 10 nematodos en etapas L4 por cepa 24 horas antes de comenzar el ensayo para asegurarse de que los organismos sean adultos jóvenes cuando se analicen. Para cada mutante o nematodo de control analizado, elija 10 L4 (10 para el control y 10 para el ensayo).
- Mantener los organismos L4 utilizando métodos estándar durante 24 h en placas de agar estándar sembradas con OP50 Escherichia coli. Si los organismos se pierden durante las etapas de lavado subsiguientes, compénselo aumentando el tamaño de la muestra inicial (es decir, elija 20 lombrices en lugar de 10).
NOTA: El comportamiento es un fenotipo innatamente variable. Realice el método por triplicado para cada cepa en tres días separados. Incluya cepas de control adicionales y condiciones para cepas nuevas, como se destaca en la sección de discusión.
- Inmediatamente antes del ensayo, transfiera los organismos experimentales a una placa de agar sin bacterias y permita que los nematodos se muevan libremente durante 1 minuto para eliminar el exceso de bacterias.
- Si los organismos experimentales experimentaron condiciones de contaminación durante las 24 horas anteriores al ensayo, deséchelos.
- Pipetee 1 mL de M9 en la placa libre de bacterias para lavar los gusanos en un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar a 3.000 x g durante 1 min. Los gusanos deben formar una bolita en el fondo del tubo. Aspire la solución M9 sin alterar el gránulo de gusano. Agregue 1 mL de M9 al gránulo de gusano, invierta el tubo para mezclar los gusanos con la solución.
- Repita los pasos 1.4 tres veces más.
- Si el exceso de bacterias se transfirió inicialmente con los gusanos, repita el procedimiento un total de 5 veces. No se deben transferir bacterias a las placas de cobre de la raza alimentaria. Si los alimentos se transfieren a la placa de ensayo, interferirá con la recopilación precisa de datos.
- Después del lavado final, aspire el sobrenadante hasta 100 μL de M9 y queda el pellet de gusano.
Precaución: Los comportamientos relacionados con la inanición se hacen evidentes después de 30 minutos. En consecuencia, los gusanos deben transferirse inmediatamente de la solución una vez que se hayan completado los pasos de lavado.
- Preparación de placas de ensayo
- Prepare placas de agar NGM estándar dos días antes del ensayo.
- Si las placas se mantienen en un ambiente húmedo, haga placas de agar 3 días antes del ensayo. Alternativamente, retire la tapa de la placa durante 3 a 6 h para garantizar una sequedad adecuada (si se encuentra en un ambiente estéril).
- Con un marcador permanente grueso, haga una línea en la parte inferior de la placa a lo largo del borde exterior y otra para formar una barrera de línea media (Figura 1). La barrera de la línea media debe estar equidistante de cada borde de la placa. Utilice una regla para garantizar mediciones precisas. Estas líneas servirán de guía a la hora de transferir las bacterias y la solución de cobre. Siempre que E. coli se transfiera antes de la solución de cobre, estas líneas servirán como indicadores.
- Placa de siembra con 50 μL de E. coli OP50 en un solo lado de la barrera de cobre para crear un césped uniforme (Figura 2). La concentración bacteriana debe permanecer constante en todos los ensayos; sin embargo, se ha observado poca variabilidad en respuesta a diferencias leves en la concentración.
- Use las líneas marcadas en la parte inferior de la placa para asegurarse de que las bacterias no entren en contacto con la solución de cobre. Siempre que la solución de cobre reúna el borde de la placa y forme una barrera en la línea media, transfiera las bacterias para que la solución de cobre no entre en contacto con la fuente de alimento.
- Marque un segundo juego de placas y no transfiera E. coli OP50 a ellas (Figura 2). Estas placas servirán para evaluar el control negativo. Estas placas también deben tener una marca en la mitad de la placa para denotar el origen inicial de la transferencia.
- Deje que las bacterias se sequen y luego incube las placas a 37 °C durante la noche. Asegúrese de que los parches bacterianos no se alteren cuando se transfieran a una incubadora o sala a 37 °C. Una perturbación excesiva podría alterar la ubicación o la forma del parche de comida.
- Ensayo de quimiotaxis
- Prepare una solución de sulfato de cobre (II) de 0,5 M antes de la hora de inicio del ensayo. Siempre que se utilicen 125 μL de la solución por placa, aumente este volumen en función del número de placas de ensayo utilizadas (por ejemplo, 5 placas de ensayo, 625 μL).
- Pipetear 100 μL de la solución de sulfato de cobre (II) en el borde del agar para crear una barrera exterior de cobre. La parte inferior marcada de la placa debe servir como guía.
- Pipetear 25 μL de la solución de sulfato de cobre (II) para crear una barrera en la línea media.
- Asegúrese de que la solución de sulfato de cobre (II) no entre en contacto con el parche bacteriano. Utilice una técnica de manchas, ya que las rayas pueden afectar a la locomoción debido a las hendiduras/arañazos en el agar.
- Deje que la solución de cobre se seque en la placa. El período de tiempo puede variar según la placa y las condiciones del laboratorio. Compruebe visualmente la sequedad cada 5 minutos después de la transferencia.
NOTA: La solución de cobre muestra un tinte azulado y es fácilmente identificable. Use un pañuelo de papel de laboratorio para frotar ligeramente la solución cerca del borde de la placa para discernir la sequedad.
- Pipetear 20 μL del gránulo de gusano desde el fondo del tubo en la mitad libre de bacterias de la placa de ensayo.
- Asegúrese de que se transfieran 10 gusanos a la placa de ensayo. Si accidentalmente se incluyeron gusanos adicionales, elimínelos hurgando con aceite de halocarbono para asegurarse de que no se agreguen bacterias al plato. Cada ensayo debe tener un número constante de nematodos durante el ensayo.
NOTA: Si se transfieren muy pocos gusanos durante los ensayos, el aumento del tamaño de la muestra inicial mitigará las posibles pérdidas durante los lavados y las transferencias.
- Retire el exceso de M9 de la placa con un pañuelo de laboratorio. M9 no debe entrar en contacto con la solución de sulfato de cobre (II).
Precaución: Asegúrese de que los gusanos y la superficie del agar no se vean afectados mientras realiza este paso. Si se usa con demasiada dureza, el tejido de laboratorio puede crear hendiduras en la superficie del agar de la placa y puede eliminar los gusanos. Los gusanos eliminados accidentalmente a través de KimWipe deben descartarse.
- Una vez que se haya retirado la solución M9 y todos los gusanos hayan comenzado los patrones locomotores no líquidos, inicie el cronómetro de ensayo.
- Lo ideal es retirar la solución M9 en un minuto. El parámetro esencial es la identificación de la locomoción sinusoidal. Los gusanos se manifiestan de manera diferente, por ejemplo, golpeando en lugar de sinusoidalmente, cuando están en líquido. Ponga en marcha el cronómetro del ensayo una vez que cada uno de los organismos experimentales deje de agitarse.
- Revise las placas de ensayo cada 30 min.
- En el caso de las placas de ensayo con parches bacterianos, puntúe positivamente los organismos si llegan al parche de alimentos durante un período de 4 horas. En el caso de las placas de control negativas, puntúe positivamente los organismos si han cruzado la barrera.
