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Abstract

Fuente: Turek, M. et al. Microcámaras de agarosa para la obtención de imágenes de calcio a largo plazo de Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp.(2015).

Este video presenta los conceptos detrás de las imágenes de calcio e incluye un protocolo de ejemplo para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de gusanos contenidos en pocillos de agarosa moldeados.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Turek et al, Microcámaras de agarosa para la obtención de imágenes de calcio a largo plazo de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Imágenes de calcio

1. Utilice cepas transgénicas que expresen sensores de calcio codificados genéticamente, como HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3’UTR, unc-119(+)]).
2. Utilice un microscopio compuesto equipado para la epifluorescencia de campo amplio. Conecte la salida TTL de la cámara EMCCD a la entrada TTL del LED, de modo que cada vez que la cámara grabe un fotograma se ilumine la muestra. Utilice un tiempo de exposición de unos 5 mseg. Utilice la ganancia EM en el rango de 50 a 300.
3. Especifique una película en ráfaga que se ejecute durante 24 horas con cada gusano que se visualiza cada 15 a 30 minutos, primero durante 20 segundos con DIC, luego durante 20 segundos con una fluorescencia GFP para grabar GCaMP y, a continuación, tome una imagen final de la señal mKate2 para controlar los niveles de expresión. Utilice una velocidad de fotogramas de 2/s durante cada ráfaga.
4. Para la inspección visual de datos, utilice un mapa de color falso para mejorar la visibilidad de pequeños cambios en la intensidad de la fluorescencia. Represente los datos fluorescentes como ΔF/F, siendo F el valor basal medio de la fluorescencia. En la bibliografía se puede encontrar una descripción detallada del análisis de datos de calcio.

Materials

LED system	CoolLED	pE-2
Compound microscope	Nikon	TiE
EMCCD camera	Andor	iXon 897	now sold as iXon Ultra 897
Z-stage for the microscope	Prior	Nano Scan Z
X-Y stage for the microscope	Prior	Proscan III
Red light filter	Chroma	ET660/50m
35 mm Petri dish	Falcon	Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning