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Este protocolo es un extracto de Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Cuantificación de la estructura muscular de la pared corporal
- Imágenes de fluorescencia de la estructura muscular de la pared corporal
- Obtenga una cepa (por ejemplo, RW1596) portadora del transgén stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), que marca las fibras de miosina con GFP.
NOTA: La introducción del transgén en los animales puede lograrse cruzando una cepa de interés con animales que ya expresan el transgén, o microinyectando ADN en el brazo distal de la gónada. El fenotipo "rodante" inducido por la mutación del rol-6 en este transgén facilita la visualización de los músculos. Los músculos de la pared del cuerpo corren a lo largo de los lados dorsal y ventral que normalmente están excluidos de la vista en los animales de tipo salvaje porque generalmente se encuentran en uno de sus lados laterales. El alelo rol-6 (su1006) induce la torsión de los animales, exponiendo así algunas células musculares para la obtención de imágenes.
- Tome imágenes de los animales utilizando un microscopio de fluorescencia junto con una cámara de dispositivo acoplado cargado (CCD) de alta resolución, objetivo 40X o superior, filtro GFP y software de adquisición.
- Ajuste el tiempo de exposición y la intensidad de la iluminación para evitar imágenes sobresaturadas.
- Capturar y guardar imágenes de los músculos (aumento de 400X) de una sección del animal que contenga al menos una célula muscular oblicua visible completa. Evite las regiones con una sola célula muscular que esté incompleta o secciones que estén desenfocadas. También se excluyen las imágenes de las regiones anteriores y posteriores extremas, y de las regiones adyacentes a la vulva.
NOTA: Si el animal no tiene una sola célula muscular completa visible, deslice suavemente el cubreobjetos para girar el animal y exponer una célula completa.
- Medición del área de las células musculares
- Abra la imagen en el software Fiji (se utilizó la versión 2.0.0 en este estudio).
- Utilice la selección de polígonos para trazar cuidadosamente alrededor de una sola célula muscular oblicua. Ajuste la línea del polígono al final arrastrando el punto de anclaje para mejorar el trazado.
- Vaya a la pestaña Analizar en la parte superior del software y haga clic en Medir para calcular el área de la selección. Se mostrará una tabla de resultados separada que contiene el área y otras mediciones. Si la medición del área no aparece en la tabla de resultados, vaya a Establecer mediciones en la pestaña Analizar y compruebe que la casilla del área esté marcada. Del mismo modo, desmarque otras medidas que no sean necesarias.
- En el caso de las células musculares con una región degenerada/faltante, trace la región que falta con la herramienta de selección de polígonos y vuelva a hacer clic en Medir. Si hay varios espacios dentro de la celda, trace cada espacio por separado.
- Calcule la relación entre el área de espacio y toda la célula muscular individual. Una proporción alta indica un mayor grado de degeneración muscular debido a grandes espacios dentro de la célula. Si no hay regiones faltantes, como se ve comúnmente en los animales de tipo salvaje, la relación se calcularía como cero.
NOTA: Como control, puntúe visualmente también los defectos de la estructura muscular y compare los resultados con la medición cuantitativa. Esto es especialmente útil si la cepa se estudia por primera vez en el laboratorio. Para la puntuación fenotípica, evalúe a los animales como defectuosos o no defectuosos en función de la integridad de los filamentos. Por ejemplo, los animales con pérdida de estrías de filamentos distintivos, aglomeración de GFP o espacios dentro de las células musculares debido a la ruptura estructural, se calificarían como defectuosos.