Herida epidérmica por láser: inducción de daño localizado para examinar los procesos de reparación en C. elegans

Resumen

Fuente: Xu, S. y Chisholm, A. D. Métodos para lesiones en la piel y ensayos para las respuestas a las heridas en C. elegans.J. Vis. Exp.(2014).

Este video presenta un método de herida por láser, que se utiliza para causar lesiones muy precisas en la epidermis del gusano. El protocolo de muestra proviene de un estudio de respuesta y reparación de heridas.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Xu y Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Herida por láser

NOTA: Utilice la irradiación láser de femtosegundos (800 nm) para realizar heridas más precisas.

1. Prepare almohadillas de agar en un portaobjetos de vidrio con agar derretido al 2%. Asegúrese de que las almohadillas sean similares a las almohadillas de agar utilizadas para obtener imágenes en vivo de C. elegans.
2. Transfiera 10 lombrices adultas jóvenes a la almohadilla de agarosa con un palillo de lombrices y agregue una gota de 2 μl de solución de levamisol de 12 mM. Cubra los animales y el líquido con un cubreobjetos. Espere 1-2 minutos para que los gusanos se paralicen.
3. Coloque el portaobjetos de vidrio en un microscopio confocal de disco giratorio. Mueva la platina para encontrar los gusanos y concéntrese en la epidermis sincitial lateral, anterior o posterior con un objetivo de 100X (NA 1.4-1.46).
4. Ajuste la potencia del láser de femtosegundo a 140 mW (medido antes del objetivo). Utilice el láser de femtosegundo a una velocidad de repetición de 80 MHz.
   NOTA: Dos pulsos de 200 mseg cada uno (separados por 20 mseg) son suficientes para herir en nuestras manos.
5. Concéntrese en la superficie apical de la célula epidérmica y hiera la epidermis. Observar disrupción local del citoplasma (burbujeo) o blanqueo local de cualquier marcador fluorescente utilizado.
   NOTA: Siga los procedimientos de seguridad adecuados para el láser cuando utilice el láser de femtosegundo. Los escaneos lineales o puntuales que utilizan láseres de femtosegundo, como los de los microscopios de dos fotones, deberían proporcionar suficiente potencia para el heridor >NOTA: Si bien no tenemos experiencia directa con el uso de otros láseres, en principio las heridas deberían ser posibles utilizando láseres UV convencionales (como los utilizados en las ablaciones de células de C. elegans). Opcionalmente, se utiliza un módulo de Recuperación de Fluorescencia Después del Fotoblanqueo (FRAP) en disco giratorio confocal para herir la epidermis (N. Pujol, comunicación personal).