Alimentación con dextrano FITC: un método para cuantificar la permeabilidad intestinal en C. elegans

Resumen

Fuente: Le, T. A. N., et al. Medición de los efectos de bacterias y productos químicos en la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

Este video presenta un método para visualizar y medir la integridad de la luz intestinal de C. elegans alimentando gusanos con dextrano marcado con FITC. El protocolo de ejemplo muestra el ensayo realizado con gusanos tratados con 3,3'-diindolilmetano (DIM) y alimentados con patógenos.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparación de placas NGM para probar los efectos de un producto químico (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con P. aeruginosa
   1. Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 mL de agua destilada, un agitador magnético y 6,8 g de agar a una botella de vidrio de 500 mL (agar NGM).
   2. Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 mL de agua destilada y un agitador magnético sin agar a otra botella de vidrio de 500 mL (caldo NGM).
   3. Esterilizar en autoclave los dos frascos (de los pasos 1.1 a 1.2), un frasco de vidrio vacío de 100 ml y un frasco de vidrio vacío de 500 ml durante 15 min a 121 °C. A continuación, deje que el medio que contiene las botellas se enfríe a 55 °C en el baño de agua durante 30 minutos. Mantenga el medio de agar en el baño de agua y retire la botella que contiene caldo (del paso 1.2) para el siguiente paso.
   4. Agregue los productos químicos aditivos al caldo NGM: 0,4 mL de 1 M CaCl₂, 0,4 mL de colesterol en etanol (mL), 0,4 mL de 1 M MgSO₄ y 10 mL de 1 M KPO₄ (todos estos componentes deben esterilizarse aparte del colesterol en etanol). A continuación, agite bien la mezcla con un agitador magnético a 55 °C.
   5. Etiquete el frasco de vidrio vacío de 500 ml esterilizado en autoclave con dimetilsulfóxido (DMSO) y el frasco de vidrio vacío de 100 ml esterilizado en autoclave con DIM.
   6. Transfiera 50 mL de caldo NGM a la botella de 100 mL etiquetada con DIM. Añadir 500 μL de caldo DIM de 20 mM en el frasco y mezclar bien.
      NOTA: DIM se disuelve en DMSO (20 mM de existencias DIM).
   7. Retire rápidamente el medio de agar NGM del baño de agua, agregue 50 ml del medio de agar NGM en la botella etiquetada con DIM y mezcle bien.
   8. Coloque una alícuota de 20 mL de medio NGM que contenga DIM en cada placa de Petri de 90 mm x 15 mm. A partir de este paso se pueden fabricar aproximadamente cinco placas NGM que contienen DIM.
      NOTA: La concentración final de DIM en cada placa NGM será de 100 μM.
   9. Para preparar la placa de NGM que contiene DMSO, transfiera 150 mL de caldo de NGM a la botella de 500 mL etiquetada con DMSO. Agregue 1,5 mL de DMSO a la botella y mezcle bien.
   10. Agregue 150 mL del medio de agar NGM a la botella etiquetada con DMSO y mezcle bien.
   11. Coloque una alícuota de 20 mL de medio NGM que contenga DMSO en cada placa de Petri de 90 mm x 15 mm. A partir de este paso se pueden fabricar aproximadamente quince placas NGM que contienen DMSO.
       NOTA: La concentración final de DMSO en cada placa NGM será del 0,5%.
   12. Solidificar las placas a temperatura ambiente durante al menos 3 h y almacenarlas a 4 °C hasta su uso.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
   13. Retire el cultivo de E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 del refrigerador a 4 °C y agite el cultivo adecuadamente antes de esparcirlo a las placas NGM.
   14. Coloque 800 μL del cultivo bacteriano de E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 en cada placa de agar NGM fresca y deje que las placas se sequen en una incubadora a 20 °C durante la noche><. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Para el tercer experimento (Figura 1), se prepararon dos placas de NGM que contienen DMSO recubiertas con E. coli OP50 viva, una placa de NGM que contiene DMSO recubierta con P. aeruginosa PAO1 viva y una placa de NGM que contiene DIM recubierta con P. aeruginosa PAO1 viva.
2. Tratamiento de alimentación de bacterias o DIM y FITC-dextrano
   1. Incubar los huevos sincronizados por edad a 20 °C durante 64 h en placas NGM suplementadas con E. coli OP50 viva como alimento.
   2. Lave la larva L4 sincronizada con la edad con tampón S y transfiéralas (más de aproximadamente 500 lombrices) a las placas NGM de tratamiento que contienen diferentes bacterias y productos químicos. Incubarlos a 20 °C durante 48 h.
      NOTA: El tiempo de tratamiento puede oscilar entre 24 y 72 h, según las bacterias y los productos químicos utilizados. El efecto terapéutico o preventivo de DIM también se puede evaluar mediante el tratamiento previo de los gusanos con patógenos y luego el tratamiento de los gusanos con DIM (el efecto terapéutico) o mediante el tratamiento previo de los gusanos con DIM y luego el tratamiento con patógenos (el efecto preventivo).
   3. Para preparar las placas suplementadas con FITC-dextrano, mezcle 2 mL de E. coli OP50 inactivada por calor con 4 mg de FITC-dextrano. A continuación, divida 100 μL de la mezcla de FITC-dextrano y E. coli OP50 en veinte placas de agar NGM frescas (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio.
      NOTA: La concentración final de FITC-dextrano en cada placa NGM será de 20 μg/mL.
   4. Prepare cinco placas NGM que contengan E. coli OP50 sin FITC-dextrano para el tratamiento de control de vehículos. Para ello, divida 100 μL de E. coli OP50 inactivada por calor en cada placa de agar NGM fresca (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio.
      NOTA: Para cada experimento independiente, se requieren quince placas NGM suplementadas con FITC-dextrano y cinco placas NGM sin FITC-dextrano.
   5. Después de 48 h de tratamiento (a partir del paso 2.2), lavar los gusanos con tampón S, transferir los gusanos a las placas suplementadas con FITC-dextrano y a las placas NGM sin FITC-dextrano, e incubar las placas durante la noche (14-15 h).
      NOTA: Para cada grupo de tratamiento, se requieren 5 réplicas de tinción con FITC-dextrano (o alimentación de control de vehículo).
   6. Lave los gusanos con S-buffer y déjelos arrastrar en la placa de agar NGM fresca durante 1 h.
      NOTA: Para cada experimento independiente, se necesitan un total de 20 placas NGM frescas. En este paso, puede utilizar la placa NGM suplementada sin o con E. coli OP50.
   7. Agregue 50 μL de solución de formaldehído al 4% a cada pocillo de una placa negra de fondo plano de 96 pocillos. Transfiera aproximadamente 50 gusanos de cada placa NGM a cada pocillo para mediciones de fluorescencia. Después de 1 a 2 minutos, retire completamente todo el formaldehído de cada pocillo y agregue 100 μL de medio de montaje para cubrir los pocillos><. NOTA: Se utiliza una solución de formaldehído (4%) para inmovilizar y fijar los gusanos. Para cada grupo de tratamiento, se utilizan 5 pocillos (5 réplicas) para el análisis de imágenes.
3. Obtención de imágenes de C. elegans con el sistema de imágenes Operetta y determinación de la permeabilidad intestinal mediante la medición de la captación de fluorescencia de FITC-dextrano
   NOTA:La estereomicroscopía fluorescente se puede utilizar para el análisis de imágenes en lugar del sistema Operett.
   1. Capture imágenes de fluorescencia y mida la intensidad de la fluorescencia con el sistema de imágenes de alto contenido Operetta y analice las imágenes con el software Harmony.
   2. En el software Harmony, pulse el icono Abrir tapa para abrir la tapa y colocar la placa en la máquina.
   3. Configure los parámetros.
   4. Haga clic en Configurar, seleccione el tipo de placa (corning de fondo plano de 96 pocillos) y agregue los canales (canales de campo claro y EGFP).
   5. Ajusta el diseño. Vaya a la selección de diseño y, a continuación, seleccione Pista y ajuste los parámetros (primera imagen a 1 μm, el número de planos es 10, la distancia es 1 μm).
   6. Seleccione uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura y presione Probar para verificar si las imágenes son satisfactorias en la sección Ejecutar experimento.
   7. Si las imágenes son satisfactorias, regrese a la sección Configuración y presione el ícono Restablecer al final de la pantalla. A continuación, seleccione todos los pozos objetivo y un número adecuado de campos de captura.
   8. Vaya de nuevo a Ejecutar experimento e introduzca el nombre de la placa y, a continuación, pulse Iniciar para comenzar el procesamiento.
   9. Para medir la intensidad de la fluorescencia, vaya a la sección de análisis de imágenes e ingrese la imagen. Encuentre la celda eligiendo el canal EGFP y el método B. Ajuste el umbral común a 0,5, el área a >200 μm², el factor de división a 3,0, el umbral individual a 0,18 y el contraste a más de 0,18. A continuación, calcule las propiedades de intensidad y elija la media como salida. Pulse el icono Aplicar para guardar la configuración.
   10. Vaya a la sección Evaluación para medir la intensidad obteniendo un mapa de calor y una tabla de datos. Establezca el parámetro Lectura en Celdas — Intensidad, Celda, EGFP, Media — Media por Pozo e inicie la evaluación.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
   11. Para extraer los datos de Operetta, haga clic en el botón Configuración y elija Administración de datos.
   12. Elija Escribir archivo y, a continuación, abra la exploración y seleccione el archivo.
   13. Para seleccionar el archivo, haga clic en la señal + pequeña en la esquina izquierda y, a continuación, haga clic en Medición y elija Nombre de la placa.
   14. Seleccione el archivo y haga clic en Aceptar.
   15. Seleccione la ruta para guardar el archivo haciendo clic en la señal Examinar en la ruta activa.
   16. Haga clic en Iniciar para guardar el archivo de datos.
       NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
4. Análisis estadístico de la fluorescencia de dextrano FITC de C. elegans
   1. Importe los datos y calcule la media y la desviación estándar (DE) utilizando un software de estadísticas.
   2. Analice la diferencia significativa con el análisis de varianza de un factor (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Resultados

Figura 1: Efecto del DIM sobre la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentado con P. aeruginosa.Imágenes microscópicas de gusanos de (A) E. coli OP50 sin alimentación con FITC-dextrano, (B) E. coli con alimentación con FITC-dextrano, (C) P. a...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3,3'-diindolilmetano	Sigma	D9568
90×15 mm Placas de Petri	SPL Ciencias de la Vida, Corea del Sur	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Solución de formaldehído	sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)		Tipo salvaje
Colesterol	sigma	C3045
Placa de ensayo Costa, 96 pocillos negros con fondo plano transparente sin tratar, sin tapa de poliestireno	Corning Incorporado	REF. 3631
Dimetilsulfóxido	sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)
Isotiocianato de fluoresceína - dextrano	sigma	FD10S
Software Harmony	PerkinElmer		versión 3.5
Sulfato de magnesio heptahidratado	Biorreactivos de Fisher	BP2213-1
Medio de montaje acuoso de montaje fluorado	sigma	F4680
Operetta CLS Sistema de análisis de alto contenido	PerkinElmer	HH16000000
Peptona	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Colección coreana para la cultura tipográfica	KCTC Nº 1637
Cloruro de sodio	Biorreactivos de Fisher	BP358-1
Microscopio estereoscópico	Nikon, Japón	SMZ800N