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El siguiente protocolo es un extracto de Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018).
1. Montaje RNP
- Diseñe el experimento con mucha anticipación, adquiriendo todos los componentes de ARN, ADN y proteínas con anticipación. Como primer paso, pruebe uno de los controles positivos enumerados en la Tabla 1 y utilice los reactivos comerciales descritos en la Tabla de Materiales para garantizar un diseño experimental confiable y la integridad de los materiales. Para obtener sugerencias adicionales sobre cómo planificar un nuevo experimento de edición del genoma, consulte los documentos sobre este tema.
NOTA: Una vez ensamblados como se describe en los pasos siguientes, los RNP preparados de antemano pueden almacenarse a -80 °C.
- Después de elegir a qué gen dirigirse, utilice una de las herramientas gratuitas en línea para diseñar un ARNg óptimo. Asegúrese de apuntar a un exón si espera generar un knockout.
NOTA: Estas herramientas ayudarán a identificar un sitio objetivo con una secuencia PAM adyacente de S. pyogenes, una puntuación de alta calidad y una puntuación baja fuera del objetivo.
- Purifique la proteína Cas9 de S. pyogenes a través de métodos publicados o cómprela a un proveedor comercial.
- Prepare un tampón Cas9 típico para la dilución de ARN, la preparación de RNP y el almacenamiento de proteínas, que contiene 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de KCl, 10% de glicerol y 1 mM de TCEP. Utilice siempre agua sin nucleasas en tampones que se utilizarán para resuspender o diluir el ARN para evitar la degradación.
- Producir el ARN guía (tracrRNA y crRNA o sgRNA) a través de una transcripción in vitro utilizando métodos publicados, o comprarlo a una empresa de síntesis de ácidos nucleicos.
- Si inserta un gen, sintetice o compre una plantilla de ADN de un donante.
- Almacene las alícuotas de proteína y ARN a -80 °C y descongele en hielo inmediatamente antes de usar.
NOTA: Cada congelación-descongelación reduce ligeramente la eficiencia. Los protocolos detallados de acceso abierto para la purificación de Cas9 y la transcripción in vitro de sgRNAs están disponibles en otros lugares.
- Preparación de RNP para la edición de C. elegans: Ensamble el complejo RNP agregando los siguientes reactivos para crear un volumen final de 20 μL (las concentraciones finales se anotan entre paréntesis): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), y las plantillas de reparación si es necesario (0,5 μM de ssDNA o hasta 350 ng/μL de dsDNA).
NOTA: La eficiencia de una reparación mediada por Cas9 con plantilla DSB es proporcional a la concentración de la construcción de reparación de dsDNA; Por lo tanto, cuanto mayor sea la concentración de la plantilla de reparación, más eficiente será la reparación de la plantilla. Sin embargo, se ha demostrado que una inyección de mezclas que contienen más de 350 ng/μL de dsDNA reduce la viabilidad de los gusanos inyectados. Por lo tanto, es mejor usar hasta, pero no más de 350 ng/μL de dsDNA en la mezcla para maximizar la eficiencia de reparación y minimizar su letalidad.
- Agregue múltiples crRNAs para dirigirse a múltiples loci simultáneamente, según sea necesario para el enfoque de detección de co-CRISPR/co-conversión. Al agregar más de un crRNA, agregue cada uno secuencialmente a la mezcla maestra.
NOTA: La cantidad de cada crRNA no tiene por qué ser la misma, e incluso duplicar la concentración total de crRNAs en la mezcla maestra sin cambiar la concentración de Cas9 no parece interferir con la frecuencia de mutagénesis en un locus específico. Los ejemplos se describen en detalle en Paix et al.
- Mezclar pipeteando y centrifugar la solución de RNP a 16.000 x g durante 5 s para asegurarse de que la solución se recoja en el fondo del tubo.
- Incubar la solución a 37 °C durante 15 m.
- Centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 1 minuto para granular cualquier partícula que pueda obstruir la aguja de microinyección de orificio fino. Utilice el sobrenadante en los pasos siguientes.
- C. elegans Preparación
1. 1 día antes de la microinyección: Prepare las almohadillas de agarosa para la microinyección.
- Haga una solución de agarosa al 3% (p/v) en agua agregando agarosa al agua y llevando la solución a ebullición en una placa caliente o en un microondas.
- Coloque portaobjetos de cubreobjetos de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm sobre una mesa y utilice una pipeta Pasteur de vidrio para colocar una pequeña gota (~15 μL) de solución de agarosa en el portaobjetos. Aplana rápidamente la gota de agarosa colocando otro cubreobjetos encima. Deje que la agarosa se solidifique y luego retire uno de los cubreobjetos.
- Deje secar el cubreobjetos recubierto de agarosa boca arriba sobre una mesa durante la noche. Después de 24 h, guarde las almohadillas de agarosa en un recipiente limpio y seco.
NOTA: Estos se pueden usar indefinidamente.
2. Tire de las agujas de microinyección: utilizando capilares de vidrio de borosilicato con filamentos (diámetro exterior 1,0 mm y diámetro interior 0,58 mm), tire de las agujas basadas en Mello y Fire57 y otros recursos. Las agujas se pueden usar inmediatamente o se pueden almacenar en un recipiente limpio y seco, apuntalado por soportes de arcilla.
3. Para el mantenimiento de los gusanos, prepare un agar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) vertido en placas de Petri y manchado con bacterias OP50 (para protocolos sobre el mantenimiento estándar de C. elegans y recetas para medios de crecimiento, consulte Stiernagle).
4. Preparar los gusanos para la microinyección: 12-24 h antes de la microinyección, recoger hermafroditas en etapa L4 en una nueva placa de agar NG con bacterias OP50 e incubarlos durante la noche a 20 °C. Para cada mezcla de objetivo/inyección Cas9, elija ~ 30 gusanos en el plato.
- Día de microinyección: Cargue la aguja de microinyección estirada con el sobrenadante de solución RNP preparado en el paso 1.2.
- Pipetear el sobrenadante del paso 1.2.4 en una pipeta capilar estirada y rellenar la solución de la pipeta capilar en la aguja de microinyección preparada (generalmente con una carga inferior a 0,1 μL).
- Monte la aguja cargada en el aparato de microinyección conectado a un micromanipulador. Ajuste la presión del aparato de inyección a 250 kPa y la presión de equilibrio a 25 kPa.
- Rompe la punta de la aguja cargada para generar un borde afilado. Coloque un cubreobjetos cuadrado de 15 mm x 15 mm x 1,5 mm en la parte superior de un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
- Superponga un borde del cubreobjetos cuadrado con aceite de halocarbono 700.
- Coloque la aguja en el aceite, en el borde del cubreobjetos cuadrado de 15 mm.
- Con una mano para guiar la platina del microscopio y el cubreobjetos, cepille el portaobjetos hacia arriba y a lo largo del borde de la aguja mientras presiona el pedal/botón de inyección. Rompa la punta de la aguja hacia atrás, aumentando el flujo del líquido fuera de la aguja. Logre un caudal óptimo haciendo que la mezcla de inyección fluya hacia arriba a lo largo del borde de la aguja, formando ~ 1 burbuja / s.
- Confirme que los gusanos L4 seleccionados 12-24 h antes de la microinyección son adultos jóvenes en etapa de desarrollo el día de la inyección. Escoja los gusanos adultos jóvenes en una placa de agar NG que carezca de bacterias OP50 y déjelos arrastrar durante 5 minutos. Esto reduce la cantidad de bacterias transferidas a la almohadilla de inyección, minimizando las obstrucciones de la aguja.
- Coloque una almohadilla/cubreobjetos de agarosa en un endoscopio de disección. Con un palillo de gusano, coloque una pequeña pista de aceite de halocarbono a lo largo de un borde de la almohadilla.
- Usando el pico de gusano recubierto de aceite, levante varios gusanos de la placa de agar NG y colóquelos en el rastro de aceite. Con un pelo fino unido a una pipeta, como una pestaña o un bigote de gato, coloque los gusanos en paralelo, empujándolos suavemente hacia la almohadilla de agarosa. Hasta que se sienta cómodo con el procedimiento de microinyección, solo monte e inyecte un gusano a la vez.
NOTA: La agarosa seca absorberá la humedad de los gusanos, haciendo que se adhieran a la almohadilla. En consecuencia, hay que trabajar rápidamente ya que los gusanos pueden desecarse.
- Una vez en posición y unido a la almohadilla, superponga los gusanos con otras gotas de aceite de halocarbono (~ 20 μL) de la punta del pico de gusano.
- C. elegans Microinyección de gónadas con RNPs y cuidados post-inyección
El protocolo de microinyección es una adaptación de Mello y Fire y se describe en detalle en otra parte.
- Coloque el cubreobjetos con los gusanos montados en el microscopio de inyección. Bajo un aumento bajo (objetivo 5X, ocular 10X), coloque los gusanos perpendiculares a la aguja de inyección.
- Cambie a un aumento alto (objetivo 40X, ocular 10X), reposicione la aguja adyacente al brazo de la gónada correspondiente a la región cercana a los núcleos en paquiteno medio a tardío.
- Con el micromanipulador, mueva la aguja contra el gusano, presionando ligeramente la cutícula. Luego, con una mano, golpee el costado de la platina del microscopio para sacudir la aguja a través de la cutícula. Pise el pedal/botón de inyección y llene lentamente el brazo de la gónada con la mezcla de inyección y retire la aguja.
- Repita este paso con el otro brazo de la gónada.
- Una vez que se inyectan los gusanos, retire el cubreobjetos/almohadilla de agarosa y colóquelo bajo un microscopio de disección.
- Con una pipeta capilar estirada, desplace el aceite de los gusanos pipeteando un tampón M9 sobre ellos. Realiza este tratamiento para liberar los gusanos del agar.
- Después de 10 minutos, cuando los gusanos estén revolcándose en el tampón, muévalos a una placa de agar NG con bacterias OP50 usando la pipeta capilar estirada. Coloque la placa a 20 °C durante 2-3 h hasta que los gusanos se hayan recuperado y se muevan.
- Una vez recuperados, transfiera individualmente los gusanos a placas de agar NG con OP50 y transfiera las placas a una incubadora a 25 °C.
- Deje que los gusanos inyectados con P 0 crezcan y pongan progenie durante 3 días. Criba a las crías F1.
- Si utiliza co-CRISPR o co-conversión, seleccione los gusanos candidatos para el cribado en función de si tienen el fenotipo mutante del gen de referencia. Transfiera individualmente estos gusanos marcados a nuevas placas de agar NG con OP50 y permita que pongan la progenie F2 a 20 °C.
NOTA: El fenotipo utilizado para un cribado o selección co-CRISPR debe proporcionar una estimación temprana del éxito de la edición de Cas9.
- Si el fenotipo co-CRISPR no está presente, microinyecte un plásmido de control positivo para ayudar a mejorar la eficiencia de la microinyección><.
NOTA: Por ejemplo, incluir un plásmido en la mezcla de inyección que codifique MYO-2 marcado con mCherry ayudará a evaluar la eficiencia de la inyección. Los gusanos inyectados con éxito con pCFJ90 tendrán algunas crías con faringes fluorescentes.
- Examine los gusanos F1 para detectar la presencia de las ediciones deseadas. Elija la madre F1 en un pocillo individual de una placa de 96 pocillos, lísela y examine su ADN mediante amplificación de PCR específica del inserto, análisis de secuencia de ADN o ensayo de nucleasa topográfica (CEL-1).
NOTA: Estos ensayos se pueden realizar cuando se utiliza una co-CRISPR/co-conversión u otros regímenes de cribado o selección.
