Irradiación UV: un método para integrar matrices extracromosómicas

Resumen

Fuente: Mariol, M. C et al. Un protocolo rápido para la integración de matrices extracromosómicas con alta tasa de transmisión en el genoma de C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

La microinyección de transgenes generalmente resulta en cepas de C. elegans con grandes matrices extracromosómicas, que resultan en una expresión y transmisión variables del transgén. La irradiación UV puede inducir la integración cromosómica de la matriz y una transmisión transgénica más estable.

Protocolo

Este protocolo es un extracto de Mariol et al, Un Protocolo Rápido para la Integración de Matrices Extracromosómicas con Alta Tasa de Transmisión en el Genoma de C. elegans, J. Vis. Exp.(2013).

1. Irradiación UV y recuperación de gusanos transgénicos

1. Irradiación de gusanos:
   1. Escoja de 30 a 100 animales L4 transgénicos fluorescentes en placas de cultivo separadas (15 a 20 animales por placa).
   2. Coloque las placas, sin las tapas, en un reticulante UV. Irradiar los gusanos a 0,012 J/^cm2. Tenga en cuenta que las cepas son más o menos sensibles a los rayos UV y que los resultados pueden variar según el irradiador UV utilizado. Se puede probar un rango de dosis entre 0,010-0,015 J/^cm2.
2. Recuperación de lombrices después de la irradiación:
   1. Coloque las placas con gusanos irradiados durante la noche a 15 °C para su recuperación.
   2. Comprueba el número de animales que están vivos. En nuestras manos, una tasa de supervivencia de alrededor del 80-90% está adaptada para una irradiación eficiente.
   3. Cultivar los animales irradiados a 15-25 °C hasta que la progenie haya alcanzado la etapa de desarrollo, lo que permite observar la expresión del marcador de coinyección.

>2. Aislamiento de líneas transgénicas integradas

1. Selección de animales F1:
   1. Un solo animal F1 fluorescente de 150 a 200 en placas de cultivo separadas. Para líneas de alta transmisión (≥80%), 100 animales F1 son suficientes.
   2. Mantenga estas placas F1 a 15-25 °C hasta que la progenie alcance una etapa apropiada para la observación de animales F2 fluorescentes.
   3. Deseche todas las placas F1 que presenten i) ninguna progenie, lo que indica que el animal F1 era estéril o murió, o ii) ningún animal F2 fluorescente, o solo unos pocos, lo que indica que el animal F1 no transmitió el transgén a la velocidad esperada. Este paso es rápido y representa una ventaja real cuando se compara con el protocolo estándar que requiere una estimación del porcentaje de gusanos F2 fluorescentes para seleccionar placas F1 que exhiben ≥75% de progenie fluorescente (Tabla 1).
2. Selección de animales F2:
   1. Cuatro animales transgénicos F2 fluorescentes de cada placa F1 seleccionada. Cuando utilice transgenes fluorescentes (por ejemplo, mCherry, gfp o dsRed), elija gusanos F2 con un alto nivel de fluorescencia, ya que esto podría indicar que estos animales son homocigotos para la matriz integrada. Tenga en cuenta que al elegir animales F2 es fundamental no llevar huevos o larvas, para evitar falsos negativos en el siguiente paso.
   2. Cultive animales F2 a 15-25 °C.
3. Aislamiento y validación de cepas transgénicas integradas:
   1. Cribado de placas F2 para gusanos F3 transgénicos 100% fluorescentes. La pantalla es bastante rápida, ya que la presencia de un solo gusano no fluorescente indica que la placa debe desecharse. Un animal homocigoto F2 para el transgén integrado dará una progenie fluorescente 100% homocigótica.
   2. Ocho animales F3 fluorescentes de placas seleccionadas para confirmar el 100% de la herencia del transgén. En teoría, elegir un animal es suficiente en este paso. Sin embargo, puede ser necesario elegir ocho animales F3 fluorescentes para evitar seleccionar animales no fértiles o enfermos, ya que la irradiación puede inducir mutaciones aleatorias que afectan a genes importantes para la fisiología de los gusanos.
   3. Si es posible, mantener varias cepas transgénicas integradas independientes, es decir, cepas recuperadas de diferentes animales F1.

Resultados

Tabla 1. Comparación de los protocolos estándar y mejorados para la integración de matrices extracromosómicas en el genoma de C. elegans.Dos transgenes no integrados que transmiten aproximadamente a la misma frecuencia se integraron utilizando el protocolo estándar o mejorado. La principal diferencia radica en que en el protocolo estándar se realiza un cribado de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
U.V. reticulante	Fischer Scientific		Longitud de onda 254 nm
Microscopio SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Placas de Petri, 60 mm	Cml	BPS55E6
Alambre de platino 0.25 mm	Alfa Aesar	04/06/7440	Para hacer una pica para gusanos