Artículo de método

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro

DOI:

10.3791/2017

⸱

1 de junio de 2010

 , 
1Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

En este artículo

Resumen

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La migración de los linfocitos T se produce durante la recalada de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura, y entrar en los tejidos periféricos. Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para analizar la migración de los linfocitos T In vitro.

Resumen

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La migración de los linfocitos T implica la interacción adhesiva de las integrinas de la superficie celular con ligandos expresados ​​en otras células o con proteínas de la matriz extracelular. La activación precisa espacio-temporal de las integrinas de un estado de baja afinidad a un estado de alta afinidad en el borde de la célula principal es importante para la migración de los linfocitos T

Protocolo

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1. Aislamiento de linfocitos T humanos

  1. Obtener sangre humana de un donante sano. Permitir que la sangre se enfríe a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de proceder al siguiente paso.
  2. Suavemente la pipeta de 3 ml de la temperatura ambiente media del gradiente de densidad Polimorfia en un tubo de poliestireno de 8 ml de fondo redondo. Suavemente agregar 3 ml de sangre total en la parte superior de los medios de comunicación Polimorfia. Es importante evitar la mezcla de los dos reactivos.
  3. Centrifugar los tubos a 500 xg durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  4. Después de la centrifugación, las células mononucleares de sangre p....

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Discusión

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En este experimento, se proporcionan detalles sobre un sistema sencillo para analizar la movilidad de primaria linfocitos T humanos. En los ensayos de migración in vitro se han utilizado para analizar el papel de muchas moléculas y vías de señalización implicadas en la locomoción de los diversos tipos de células. Algunos controles críticos a tener en cuenta a la hora de diseñar su propio experimento de nuestro protocolo son: 1) revestimientos adhesivos no adhesivo o no la integrina-sustrato, t.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Este proyecto fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL087088 (MK) y HL18208 (MK).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMI 1640GIBCO, por Life Technologies11875
FBSThermo Fisher Scientific, Inc.SH300070.03
Penicilina-EstreptomicinaGIBCO, por Life Technologies15140
Polimorfos de 1 pasoQuímicos precisos & Corporación CientíficaAN221725
PHARemel, Thermo Fisher Scientific R30852801
Rec. IL-2 humanoR& D Systems202-IL
Rec. humano IL-15R& D Systems247-IL
Proteína GSigma-Aldrich19459
Rec. humano ICAM-1/FcR& D Systems720-IC
Rec. humano SDF-1R& Sistemas D350-NS

Referencias

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  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M.

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Etiquetas

Ensayo de migraci n celularrecubrimiento de ICAM 1estimulaci n con SDF 1an lisis por citometr a de flujoim genes de microscop abloqueo de integrinasinhibici n de la actomiosinaestimulaci n con PHAgradiente de densidad de polimorfonucleares

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