Nuevo ensayo de buceo en tanque: un método para estudiar las respuestas innatas al estrés en el pez cebra

Resumen

Fuente: Chin J.S.R., et al. Enfoques conductuales para estudiar el estrés innato en el pez cebra. J. Vis. Exp. (2019)

El artículo describe un método conductual para evaluar el estrés en el pez cebra. En respuesta al estrés, el pez cebra tiende a nadar en el fondo de un tanque hasta que se elimina el estrés. El protocolo de muestra describe el método paso a paso para realizar el ensayo.

Protocolo

1. Novedosa configuración de prueba de tanque

1. Prepare un vaso de precipitados de 250 ml precargado con agua del sistema de peces y al menos dos tanques de retención.
2. En la mañana de la prueba, transfiera al menos 10 peces cebra adultos de prueba para ser utilizados para cada condición experimental (controles y adultos experimentales) de la instalación de peces a un tanque de retención, transfiéralos a la sala de comportamiento y permita que se aclimaten durante al menos una hora><. nota: Se debe realizar un análisis de potencia antes de la experimentación, sin embargo, en nuestras manos, un n = 10 suele ser suficiente para detectar la significación estadística. Además, el tanque de retención no debe contener más de cinco individuos por litro de agua. Una aclimatación de una hora es suficiente, ya que se ha demostrado que los peces cebra adultos se habitúan a los 30 minutos de un nuevo tanque. Además, los ritmos conductuales se ven afectados por los procesos circadianos, por lo que las réplicas experimentales realizadas en diferentes días deben realizarse dentro de las mismas horas. Por lo general, realizamos todos los experimentos entre las 11:00 a.m. y las 6:00 p.m.
3. Etiquete los tanques de manera que la condición o el genotipo de los animales sea ciego para el experimentador.
   nota: Los experimentos se pueden cegar fácilmente al experimentador etiquetando los tanques con un sistema de letras o números (es decir, un tanque está etiquetado como 'A', otro como 'B', etc.). Una parte no involucrada en los experimentos etiqueta los tanques con un sistema de este tipo y enmascara las identidades del experimentador hasta después de que se complete el análisis posterior.
4. Con una red, coloque suavemente a un solo adulto en el vaso de precipitados precargado del paso 1.1. Deje que los peces adultos se aclimaten en el vaso de precipitados durante 10 minutos.
   nota: Registre el sexo del adulto, ya que podría ser importante después del análisis buscar diferencias específicas de sexo.
5. Después de la aclimatación en el vaso de precipitados, introduzca los peces en el nuevo tanque (detalles de configuración a continuación) vertiendo suavemente el agua y el adulto del vaso de precipitados.
   nota: En los pasos de esta sección se describe la configuración del nuevo ensayo de tanque. En la Figura 1B se muestra un diagrama del producto final.
   1. Coloca el tanque novedoso en el centro de la mesa.
   2. Coloque las luces infrarrojas detrás del tanque y coloque la lámina acrílica blanca o la pantalla difusora entre el tanque y la fuente de luz LED.
   3. Coloque el difusor de manera que difunda al máximo la luz proveniente de los LED, y la intensidad de la luz sea suficiente para iluminar el novedoso tanque. Cuanto más cerca esté la placa de la fuente de luz, más brillantes serán las luces, pero menos se difundirán. Por el contrario, colocar la placa difusora lejos de la fuente de luz reducirá la intensidad de la luz, pero distribuirá mejor la luz.
   4. Llene aproximadamente tres cuartas partes del nuevo tanque con agua del sistema de peces.
      nota: El agua del sistema se genera mediante ósmosis inversa del agua del grifo, seguida de una dosificación tal que la conductividad sea igual a 900 ± 100 μS, que el pH sea neutro (7,2) y que la temperatura sea de 27 ± 1 °C.
   5. Conecte la cámara al soporte de la cámara y conecte la cámara al ordenador. Abra el software de adquisición de video y ajuste la cámara para que mire hacia la parte delantera del tanque y asegúrese de que se pueda ver todo el tanque nuevo y que no haya áreas oscurecidas en el video. Ajuste el tanque y las luces infrarrojas de tal manera que haya suficiente y uniforme iluminación en todo el tanque cuando se observe a través de la cámara.
      nota: Antes de proceder a los experimentos, a menudo puede ser útil realizar una prueba, en la que se captura un video de un pez y se realiza un seguimiento. Esto asegurará que la configuración sea suficiente para la experimentación del comportamiento.
6. Después de introducir al adulto en el nuevo tanque, inicie la grabación de la cámara y aléjese de la configuración para evitar angustias adicionales a los peces.
7. Una vez finalizada la grabación, retire al individuo del nuevo tanque y colóquelo en un nuevo tanque de retención.
   nota: Se debe utilizar un tanque de retención diferente al del paso 1.2 para evitar pruebas repetidas en los mismos individuos.

Resultados

Figura 1. Diagrama de la nueva configuración del tanque.(A) Dimensiones del tanque trapezoidal de 1,8 L visto desde el lado de registro del tanque. (B) Diagrama de la configuración, incluidas las posiciones de las luces infrarrojas, la cámara y las barreras utilizadas para minimizar la interferencia humana.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
cámara			Utilizamos una cámara USB Point Grey Grasshopper3 con lente de Edmund Optics.
Filtro infrarrojo	Óptica Edmund
Programa de Adquisición de Video			Utilice programas como Virtualdub o FlyCapture porque se puede establecer la velocidad de fotogramas de adquisición.
Luces LED infrarrojas
Tanque de ensayo	Acuareo	Número de pieza ZT180	Tamaño: M3 1.8 litros
Soporte y abrazadera, o trípode estándar para cámara
Vaso de precipitados de 250 ml
Software de seguimiento			Utilizamos Ethovision XT 13 de Noldus Information Technology