Inyección ortotópica: implantación de células cancerosas específicas de tejido en un ratón adulto

Resumen

Fuente: Katsuta, E., et al. Generación de un modelo de cáncer de mama metastásico ortotópico murino y realización de mastectomía radical murina.J. Vis. Exp.(2018).

El video muestra la técnica de inoculación ortotópica del cáncer de mama en un modelo de ratón. Esta técnica produce una alta tasa de tumorigénesis con menos variabilidad en el tamaño y la forma del tumor en comparación con la inyección subcutánea o no quirúrgica.

Protocolo

1. Preparación de células (para 10 ratones)

NOTA: Las células deben inocularse dentro de 1 h después de ser separadas de la placa para evitar la disminución de la viabilidad celular. Específicamente, la suspensión celular debe mezclarse con la mezcla de proteínas gelatinosas dentro de los 15 minutos posteriores a separar las células de la placa para mantener su viabilidad.

1. Cultivo de células 4T1-luc2, una línea celular de adenocarcinoma mamario de ratón que expresa luciferasa, en medio RPMI 1640 con FBS al 10% en una incubadora humidificada a 37 °C con CO₂ al 5%.
2. Lavar las células 4T1-luc2 adherentes en un plato de 10 cm con solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizando una pipeta serológica de 10 mL. Añadir 1 mL de tripsina al 0,25% con una pipeta P1000 y, a continuación, incubar la muestra a 37 °C durante 5 min. A continuación, añada 4 mL de medio de crecimiento (RPMI-1640 con 10% de FBS) utilizando una pipeta serológica de 5 mL y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL en una campana de cultivo de tejidos. Centrifugar la suspensión celular a 180 x g durante 5 min.
3. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mL de PBS; luego, cuente las células con el hemocitómetro.
4. Suspender 2 x 10⁶ 4T1-luc2 células en 40 μL de PBS frío (pH 7,4, 4 °C) en la campana de cultivo de tejidos.
5. Mezcle la suspensión celular de 40 μL con 360 μL de la mezcla de proteínas gelatinosas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sobre hielo en la campana de cultivo de tejidos.
   NOTA: La concentración final es de 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:mezcla de proteínas gelatinosas). Para el modelo ortotópico (sin mastectomía) se utilizó 1 x 10⁴/20 μL de la concentración final, para evitar alcanzar los criterios de eutanasia (tamaño del tumor > 2 cm) en dos semanas.

2. Inoculación de células cancerosas

1. Coloque a los ratones en la cámara de inducción de anestesia con isoflurano al 2-4% y un flujo de oxígeno de 0,2 L/min hasta que los ratones respiren tranquilamente (2-3 min).
2. Agarre el ratón e inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina en su hombro por vía subcutánea.
3. Confirme la anestesia adecuada por la falta de reacción a un pinzamiento del dedo del pie. Inserte la nariz del ratón en el orificio de la máscara del ratón, que permite la anestesia inhalatoria con isoflurano al 2-4% y flujo de oxígeno de 2 L/min conectado a una unidad de bote de carbón.
4. Sujete las extremidades del ratón con cinta de laboratorio y esterilice su piel con clorhexidina, yodo y etanol al 75%, usando hisopos de algodón.
5. Haga una incisión en la piel de 5 mm en el centro de la pared torácica anterior utilizando tijeras de microdisección estériles, levante la piel del lado derecho junto a la incisión y separe la piel de la pared torácica con las tijeras, y luego, invierta la piel para exponer la almohadilla de grasa mamaria derecha # 2.
6. Inyecte cuidadosamente 20 μL de suspensión de células cancerosas utilizando una jeringa de insulina de 1 mL con una aguja de 28,5 G en la almohadilla de grasa bajo visión directa a través de la herida.
   NOTA: La aguja atraviesa la herida, no la piel. Mantenga la aguja en la almohadilla de grasa durante 5 segundos antes de sacarla, lo que da tiempo para que la mezcla de proteínas gelatinosa se solidifique.
7. Cierre las incisiones de la piel con suturas, utilizando suturas estériles 5-0 no absorbibles.
8. Después de la cirugía, devuelva a los animales a una jaula limpia y vigílelos hasta que se hayan recuperado y se muevan libremente (después de ~ 1-2 min). Si un animal no parece estar en buen estado de salud dentro de las 24 horas posteriores a la cirugía, administre buprenorfina (0,2 mg/kg).
9. Retirar las suturas bajo anestesia (ver paso 2.1) 7 días después de la cirugía.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Micro tijeras de disección	Roboz	RS-5983	Para la inoculación de células cancerosas y la mastectomía
5-0 Suturas de seda	mirar	774B F
Instituto Conmemorativo de Roswell Park 1640	Gibco	11875093	Para cultivo celular
Suero Fetal Bovino	Gibco	10437028	Para cultivo celular
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	Para cultivo celular
Esterilizante seco (Germinator 500)	Braintree Científico	GER 5287-120V	Para la inoculación de células cancerosas y la mastectomía
Portaagujas	Roboz	RS-7830	Para la inoculación de células cancerosas y la mastectomía
Pinzas Adson	Roboz	RS-5233	Para la inoculación de células cancerosas y la mastectomía
clíper	Wahl	9908-717	Para la inoculación de células cancerosas y la mastectomía
Matrigel	Corning	354234	Para la inoculación de células cancerosas