zPDX-Análisis de invasividad: investigación del comportamiento invasivo de células de cáncer metastásico en xenoinjertos de embriones de pez cebra

1. Imagen y análisis del proceso metastásico

1. Recoja varios embriones anestesiados con una pipeta Pasteur de punta ancha y transfiéralos al fondo de vidrio de una placa de poliestireno.
2. Retire el exceso de agua y guarde una cantidad limitada de agua de huevo. Manipule el embrión en su posición con una herramienta de bucle para el cabello y coloque una cubierta encima del vidrio.
3. Utilice un microscopio confocal invertido en combinación con objetivos secos de inmersión en agua o de larga distancia. Coloque el embrión de manera que la región de interés esté lo más cerca posible del objetivo.
4. Realice imágenes inmediatamente después de la anestesia para reducir el riesgo de muerte debido a la evaporación del líquido.
   1. Capture señales de la vasculatura marcada con EGFP y las células tumorales marcadas con mCherry en la misma posición en los embriones para registrar conjuntamente las células inyectadas con los vasos sanguíneos mediante la fusión de los dos canales de imagen.
   2. Para cada embrión de pez cebra, recoja dos conjuntos diferentes de imágenes de la región de la cabeza y la región de la cola.
5. Cuantificar el número de células diseminadas.
   1. Para las inyecciones en el espacio perivitelino, se cuenta el número de células de cada pez que se han diseminado desde la masa celular hacia el cuerpo embrionario del pez dentro de las regiones de la cabeza y la cola 4,15; las regiones están más allá de los límites de la cavidad cardíaca frontalmente, en la parte superior de la vejiga natatoria dorsalmente, y más allá de la abertura urogenital caudalmente.
   2. Para la inyección de Doc, cuente el número de células individuales que han invadido las fibras de colágeno de la aleta caudal desde la circulación (MDA-MB-231) o el número de grupos formados por células colectivamente (M2) en el tejido hematopoyético caudal (CHT) de cada pez cebra19.
6. Estudie la invasión y la metástasis con más detalle mediante el uso de microscopía confocal (muy recomendable).
   1. Utilice un aumento bajo (objetivo 4X) para obtener imágenes de todo el cuerpo y obtener una visión general del patrón de diseminación de las células tumorales.
      NOTA: Un aumento mayor (objetivos de 20X y 40X) es adecuado para estudiar la angiogénesis intra y peritumoral y la localización precisa de las células diseminadas en el cuerpo embrionario.
   2. Utilice un láser de 488 nm para escanear la vasculatura del embrión de pez cebra y un láser de 543 nm para escanear las células tumorales implantadas marcadas con fluorescencia roja. Obtenga una imagen de alta calidad escaneando cada embrión en ocho a diez pasos. Escanee y promedie cada paso seis veces.
7. Vuelva a colocar con cuidado el embrión en el agua del huevo si es necesario para experimentos posteriores.