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1. Descelularización
NOTA: Este procedimiento fue adaptado de métodos publicados anteriormente centrados en la descelularización adiposa, que incluían el detergente iónico desoxicolato de sodio en lugar de dodecil sulfato de sodio para eliminar el ADN de manera eficiente.
- El día 1, retire las almohadillas de grasa mamaria congeladas o MFP a -80 °C y descongele a temperatura ambiente.
- Una vez descongeladas, seque brevemente las impresoras multifunción con una toallita delicada. Pese las impresoras multifunción con una báscula analítica.
- Con un par de pinzas con tijeras o un bisturí, divida el tejido en muestras de 3 mm x 3 mm x 3 mm para estudiar la MEC intacta y el tejido restante para la producción de hidrogel><.
nota: El número de muestras depende del número de métodos de ensayo, por ejemplo, a continuación se describe la recogida de dos muestras: una para la inclusión en parafina (paso 1.5) y otra para la congelación en medio de inclusión de criostato, si se desea (véase la Tabla de materiales y el paso 1.6).
- Pesa los tejidos. Si se incrusta en parafina para seccionar, continúe con el paso 1.5. Si se congela en un medio de inclusión de criostato para el corte, continúe con el paso 1.6.
- En una campana química, sumerja el tejido en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% (consulte la Tabla de materiales) durante 24 h a 4 °C. Lavar 3 veces en PBS durante 5 minutos cada una. Sumergir el tejido en sacarosa al 30% durante 48 h a 4 °C.
- Pesa el pañuelo ahora que se ha extraído esta pieza. Continúe con el paso 1.6.
- En una campana química, coloque las piezas de MFP en un casete etiquetado preparado con medio de inclusión de criostato. Agregue más medio de inclusión de criostato para cubrir el tejido.
- Coloque el casete en un vaso de precipitados de 2-metilbutano (consulte la Tabla de materiales) que se preenfría con nitrógeno líquido. El vaso de precipitados debe tener suficiente 2-metilbutano para cubrir el fondo, pero no lo suficiente como para sumergir el casete, ya que el medio de inclusión del criostato no debe tocar el 2-metilbutano. Deje reposar el casete en el 2-metilbutano hasta que el medio de inclusión del criostato se congele y se vuelva opaco.
- Envuelva los casetes en papel de aluminio, etiquételos y déjelos a -80 °C hasta que se utilicen para seccionar.
nota: Los tejidos colocados inmediatamente en el medio de inclusión del criostato se seccionaron a 5 μm, mientras que los tejidos incubados en sacarosa se seccionaron a 30 μm para conservar la morfología de los adipocitos.
- Use pinzas para masajear manualmente el tejido restante.
nota: Las piezas de tejido también pueden colocarse en NBF al 10% durante 24-48 h, enjuagarse en PBS y dejarse en etanol al 70% hasta su inclusión en parafina. Después de la inclusión, se pueden utilizar secciones de 5 μm para la tinción con hematoxilina y eosina (H y E) (ver sección 2 a continuación).
- Coloque las impresoras multifunción en platos de 6 cm con 5 ml de solución de tripsina al 0,02 % y EDTA al 0,05 %. Incubar a 37 °C durante 1 h. Rocíe y limpie los platos con etanol al 70% antes de colocarlos en la incubadora.
- Utilice filtros de 0,7 mm para lavar las impresoras multifunción con agua desionizada (DI) vertiendo agua sobre el pañuelo tres veces. Use fórceps para masajear manualmente el tejido entre lavados.
- Seque brevemente el pañuelo en una tarea delicada, limpie y pese. Coloque los pañuelos de papel en un vaso de precipitados preesterilizado en autoclave que contenga una barra para agitar del tamaño adecuado. Cubra los tejidos con 60 mL de t-octilfenoxipolietoxietanol al 3% (consulte la Tabla de materiales) por 1 g de tejido y revuelva durante 1 h a temperatura ambiente. Use un mínimo de 20 mL.
- Vierta el pañuelo y el contenido en un colador. Enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y viértalo sobre pañuelos desechables. Repite dos veces más. Use fórceps para masajear manualmente el pañuelo entre enjuagues.
- Seque brevemente el pañuelo en una tarea delicada, limpie y pese. Vuelva a colocar los pañuelos y las barras agitadoras en los mismos vasos de precipitados y cúbralos con 60 ml de ácido desoxicólico al 4% por 1 g de pañuelo. Removemos durante 1 h a temperatura ambiente. Use un mínimo de 20 mL.
- Vierta el pañuelo y el contenido en un colador de malla. Enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y viértalo sobre pañuelos desechables. Repite dos veces más. Use fórceps para masajear manualmente el pañuelo entre enjuagues.
- Seque brevemente el pañuelo en una tarea delicada, limpie y pese.
- Coloque los pañuelos de papel en el mismo vaso de precipitados con agua desionizada fresca suplementada con penicilina-estreptomicina al 1%. Cubra herméticamente con una película de parafina. Dejar actuar toda la noche a 4 °C.
- Lave los coladores y vasos de precipitados para usarlos al día siguiente.
- El día 2, escurra el contenido del vaso de precipitados en un colador. Seque brevemente el pañuelo en una tarea delicada, limpie y pese.
- Coloque las impresoras multifunción en el mismo vaso de precipitados con una barra de agitación del tamaño adecuado. Cubrir con 60 mL de solución de etanol al 4%/ácido peracético al 0,1% por 1 g de tejido. Use un mínimo de 20 mL. Removemos durante 2 h a temperatura ambiente.
- Vierta el pañuelo y el contenido en un colador de 0,7 mm. Use fórceps para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lave el pañuelo cubriéndolo con 60 ml de 1x PBS por 1 g de pañuelo. Use un mínimo de 20 mL. Revuelva durante 15 minutos a temperatura ambiente. Repita una vez.
- Vierta el pañuelo y el contenido en un colador de 0,7 mm. Use fórceps para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lave el pañuelo cubriéndolo con 60 ml de agua desionizada por 1 g de pañuelo. Use un mínimo de 20 mL. Revuelva durante 15 minutos a temperatura ambiente. Repita una vez.
- Seque brevemente el pañuelo en una tarea delicada, limpie y pese. Vierta el pañuelo y el contenido en un colador. Use fórceps para masajear manualmente el tejido.
- Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Cubrir los tejidos con 60 mL de n-propanol al 100% por 1 g de tejido. Use un mínimo de 20 mL. Removemos durante 1 h a temperatura ambiente.
- Seque brevemente el pañuelo en una tarea delicada, limpie y pese. Vierta el pañuelo y el contenido en un colador de 0,7 mm. Use fórceps para masajear manualmente el tejido.
- Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lave el pañuelo cubriéndolo con 60 ml de agua desionizada por 1 g de pañuelo. Use un mínimo de 20 mL. Revuelva durante 15 minutos a temperatura ambiente. Repite tres veces.
- Vierta el pañuelo y el contenido en un colador. Repita los pasos 2.3 a 2.6 para recolectar trozos de tejido para la incubación y congelación de sacarosa en un medio de inclusión de criostato.
- Seque brevemente el pañuelo en una tarea delicada, limpie y pese. Colóquelo en un tubo de 15 ml etiquetado. Congelar a -80 °C durante la noche.