Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Tratamiento con bleomicina
- Planee inyectar bleomicina a los ratones por vía intratraqueal 14 días antes del injerto de células tumorales.
- Descongele el caldo de bleomicina en hielo 2 horas antes de la inyección.
- Una vez descongelada, diluya la bleomicina hasta la concentración de trabajo deseada (0,02 U/50 μL o 0,005 U/50 μL) y manténgala en hielo><.
nota: La concentración de bleomicina depende de la cepa de ratón utilizada para los experimentos (Tabla 1). Se debe realizar la titulación de bleomicina en ratones para determinar la dosis óptima.
- Prepare la anestesia diluyendo ketamina y xilacina hasta una concentración final de 10 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente, Utilizando una jeringa de 1 mL y una aguja de 27 G, anestesiar a cada ratón inyectando por vía intraperitoneal una solución de ketamina/xilacina a 100/10 mg/kg respectivamente.
- Controle la respiración de los ratones y emplee un pellizco en los dedos de los pies. Confirme la anestesia adecuada cuando el ratón no responde al pellizco del dedo del pie. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Coloque 1 ratón a la vez en una plataforma de intubación colgando sus dientes frontales con la espalda contra la plataforma.
- Ilumine la parte superior del tórax con un iluminador de fibra óptica para ayudar con la visualización de la tráquea. Abra la boca del ratón y saque la lengua suavemente con pinzas planas estériles.
- Use un catéter intravenoso sin la aguja para evitar obstruir la respiración. Coloque el catéter sobre la luz blanca emitida por la abertura de la tráquea.
- Inserte el catéter en la tráquea hasta que la parte superior del catéter llegue a los dientes frontales. Confirme la colocación correcta del catéter en la tráquea visualizando la luz blanca que brilla a través de la abertura del catéter en la boca.
- Con una pipeta, dispense 50 μL de bleomicina o vehículo (PBS) directamente en el catéter para asegurarse de que se inhala todo el volumen. Realice este paso en condiciones estériles.
- Si el catéter está insertado correctamente, el ratón inhalará inmediatamente el contenido del catéter. Espere unos segundos hasta que todo el volumen desplazó por el catéter. A continuación, retire el catéter de la tráquea y deséchelo en una solución de lejía al 10%.
nota: El tiempo medio por ratón de los pasos 1.7-1.11 es de unos 5 min.
- Si el ratón no está inhalando el líquido, controle cuidadosamente la respiración y ajuste la posición del catéter. Si el ratón deja de respirar, retire el catéter inmediatamente y permita que el ratón reanude la respiración normalmente antes de volver a insertar el catéter.
- Coloque el mouse inyectado en una almohadilla térmica aprobada por IACUC en su espalda sobre una superficie plana para su recuperación. Todo el procedimiento tomará 10 minutos por mouse. No devuelva un animal que haya sido inyectado a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Coloque una tarjeta de "Producto químico peligroso en uso" en la jaula durante 24 h.
>2. Injerto de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón
NOTA: Realizar el injerto de células 14 días después de la inyección de bleomicina (paso 1.1)
- Deje que las células crezcan enmatraces de 75 cm2 sin perturbaciones durante 3 días antes del día de la inyección con los medios correspondientes como se indica en el paso 1.3.
nota: Deben tener un 80% de confluente el día de la inyección (lo que corresponde a 2-3 x 106 en cada matraz dependiendo de la línea celular).
- Lavar las células que crecen enmatraces de 75 cm2 con 5 mL de PBS a temperatura ambiente.
- Aspirar PBS y añadir 1,5 mL de tripsina a las células e incubar las células a 37 °C hasta que las células se desprendan (normalmente 2-5 min).
nota: Recomendamos comprobar cada 2 minutos si hay desprendimiento de células del plástico mediante una simple visualización del fondo del matraz o bajo un microscopio óptico. No exceder los 5 min de incubación con tripsina.
- Neutralice la tripsina añadiendo 4 mL de medio que contenga un 10% de FBS (el mismo medio que el paso 2.1). Recoja las células en un tubo de 15 ml y centrifuérrelo a 200 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet de celda en 5 mL de PBS para lavar las celdas. Centrifugar las celdas a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente para peletizar celdas. Repita esto 1 vez.
- Aspirar el PBS y resuspender el pellet en 1,5 mL de PBS por matraz.
- Mezcle 50 μL de mezcla celular con 50 μL de azul de tripano y cuente las células usando una cámara de contador de células/hemocitómetro.
- Prepare la suspensión celular diluyendo las células en PBS para inyectar 1 x 105 células (u otra cantidad indicada) en 50 μL por ratón. Mantenga las células en hielo antes de la inyección.
nota: Prepare al menos dos veces más células para la inyección a fin de evitar quedarse sin suspensión celular.
- Preparar la anestesia diluyendo ketamina y xilacina hasta una concentración final de 10 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente, Utilizando una jeringa de 1 mL y una aguja de 27 G, anestesiar a cada ratón inyectando una solución de ketamina/xilacina por vía intraperitoneal a 100/10 mg/kg respectivamente.
- Controle la respiración de los ratones y emplee un pellizco en los dedos de los pies. Confirme la anestesia adecuada cuando el ratón no responde al pellizco del dedo del pie. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Coloque 1 ratón a la vez en una plataforma de intubación colgando sus dientes frontales con la espalda contra la plataforma.
- Ilumine la parte superior del tórax con un iluminador de fibra óptica para ayudar con la visualización de la tráquea.
- Vuelva a suspender las células suavemente con una pipeta p200 para asegurarse de que no formen grumos. Abra la boca del ratón y saque la lengua suavemente con pinzas planas estériles.
- Use un catéter intravenoso sin la aguja para evitar obstruir la respiración. Coloque el catéter sobre la luz blanca emitida por la abertura de la tráquea.
- Inserte el catéter en la tráquea hasta que la parte superior del catéter llegue a los dientes frontales. Confirme la colocación correcta del catéter en la tráquea visualizando la luz blanca que brilla a través de la abertura del catéter en la boca.
- Con una pipeta, dispense 50 μL de células directamente en el catéter para asegurarse de que se inhala todo el volumen. Realice este paso en condiciones estériles.
nota: Si el catéter está insertado correctamente, el ratón inhalará inmediatamente el contenido del catéter.
- Espere unos segundos hasta que todo el volumen recorra el catéter y luego retire el catéter de la tráquea y deséchelo en una solución de lejía al 10%.
- Si el ratón no inhala el líquido, controle cuidadosamente la respiración y ajuste la posición del catéter. Si el ratón deja de respirar, retire el catéter inmediatamente y permita que el ratón reanude la respiración normalmente antes de volver a insertar el catéter.
nota: El tiempo medio por ratón de los pasos 2.11-2.18 es de unos 5 min.
- Coloque el mouse inyectado en una almohadilla térmica aprobada por IACUC en su espalda sobre una superficie plana para su recuperación.
nota: Todo el procedimiento tomará 10 minutos por mouse. No devuelva un animal que haya sido inyectado a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Afeitar toda la zona de las costillas, tanto ventral como dorsalmente, de B6129SF1/J y otras cepas de ratón con pelo oscuro utilizando una afeitadora eléctrica antes de la toma de imágenes.
- 2-3 min después de la inyección celular, inyecte 100 μL de luciferina por vía retroorbital (15 mg/mL) con una aguja de insulina. Alternar el ojo utilizado para la inyección en cada sesión de imagen.
- Después de al menos 2 minutos, coloque hasta 5 ratones en un generador de imágenes de bioluminiscencia animal en la posición de decúbito dorsal y adquiera una imagen ventral utilizando los ajustes de luminiscencia.
- En el panel de control, ajuste la configuración de resolución y sensibilidad para medir la luminiscencia de una línea celular determinada. Para la mayoría de las aplicaciones, comience con 3 min (o "Auto" si está saturado), binning = Medio (4), F / Stop = 1, Campo de visión = D, Altura del sujeto = 1.50.
nota: Si la inyección tiene éxito, se detecta una señal de luminiscencia en la zona superior del tórax, en un pulmón o en ambos pulmones.
- Voltea a los ratones a la posición de decúbito esternal y adquiere una imagen dorsal como la anterior.
nota: Si la inyección de células no se realiza correctamente, las células pueden agruparse en la entrada de la tráquea o en el cuello.
- Inyectar ketoprofeno 5 mg/kg por vía intraperitoneal para aliviar el dolor.
- Lleve a los ratones de regreso a su jaula y coloque una tarjeta de "Agente BSL-2 en uso" en la jaula.
- Monitoree a los ratones para detectar dificultad respiratoria inmediatamente después de la intubación, y luego cada 15 minutos hasta que los ratones se despierten de la anestesia. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Examinar a los ratones 24 horas después de la intubación y tres veces por semana para detectar cualquier signo de morbilidad.
- Llevar un registro en el cuaderno de bitácora de la fecha del procedimiento, identificación del animal, tipo de procedimiento, tipo de anestésico y observaciones y tiempos de seguimiento postoperatorio.
- Monitoree a los ratones para detectar pérdida de peso, dificultad respiratoria, anomalías de comportamiento y una puntuación de condición corporal <2 (la segmentación de los huesos de la columna vertebral es evidente/dorsal pélvico es palpable) dos veces por semana después de la inoculación de bleomicina.
nota: Los ratones con tumores pulmonares pueden presentar irritación respiratoria, pérdida de peso, caquexia y/o la muerte.
- Eutanasiar a ratones con dificultad respiratoria o ratones que hayan experimentado una pérdida del 15% de la masa corporal por dióxido de carbono o por ketamina/xilacina seguida de dislocación cervical si se recolectan tejidos. Confirmar la eutanasia mediante la realización de palpaciones para la actividad respiratoria.
>3. Monitorización del crecimiento tumoral mediante imágenes de bioluminiscencia
- Repita las imágenes de los ratones el día 3 después del injerto y semanalmente a partir de entonces.
- Anestesiar a los ratones inyectando ketamina/xilacina (como se describe en los pasos 2.4-2.5) o inhalando isoflurano (2%). Controle la respiración de los ratones y emplee un pellizco en los dedos de los pies para confirmar la anestesia adecuada. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Afeitar toda el área de las costillas, tanto ventral como dorsalmente, de B6129SF1/J y otras cepas de ratón con vello oscuro con una afeitadora eléctrica antes de tomar imágenes.
- Una vez que los ratones estén bajo anestesia, inyecte 100 μL de luciferina retroorbitalmente (15 mg/mL) usando una aguja de insulina. Espere 2 min. Alternar el ojo utilizado para la inyección en cada sesión de imagen.
- Coloque ratones en el generador de imágenes y adquiera imágenes dorsales y ventrales como se describe en los pasos 2.22-2.24.
- Coloque a los ratones de nuevo en la jaula después de la toma de imágenes, boca arriba sobre una superficie plana para su recuperación.
nota: Todo el procedimiento durará 5 minutos por grupo de 5 ratones. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Analice las imágenes utilizando el generador de imágenes/software de análisis de bioluminiscencia.
