Aumento de dosis: un método para desarrollar resistencia a los medicamentos en las células cancerosas

Resumen

Fuente: Yamaoka T. et al., Establecimiento y caracterización de tres líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón PC-9 resistentes a Afatinib desarrolladas con dosis crecientes de Afatinib. J. Vis. Exp., 2019

El video describe el desarrollo de resistencia a los medicamentos en las células cancerosas al exponer las células a dosis crecientes de un medicamento después de calcular los valores de IC₅₀ del medicamento previamente con el ensayo MTT. El protocolo de muestra describe el proceso paso a paso del desarrollo de células resistentes a los medicamentos.

Protocolo

1. Establecimiento de tres líneas celulares PC-9 independientes resistentes a afatinib

1. Determinación de la concentración inicial de exposición a afatinib para células PC-9 mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).
   1. Cultivo de células PC-9 en un medio de crecimiento que contiene suero fetal bovino (10%), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) en una placa de 10 cm tratada con cultivo celular en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C.
   2. Resuspenda las células PC-9 a 4 x 10⁴ células/mL en medio de crecimiento y luego siembre a 50 μL/pocillo en una microplaca de 96 pocillos. La concentración final de células es de 2,0 x 10³ células/50 μL/pocillo. Incubar durante la noche en una incubadora con 5% de_CO2 a 37 °C.
   3. Añadir 50 μL de solución de afatinib a diferentes concentraciones: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 y 20 μM a los pocillos que contienen el medio de crecimiento (50 μL). El volumen final y las concentraciones de afatinib son 100 μL y 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 y 10 μM, respectivamente.
   4. Incubar la placa de 96 pocillos durante 96 h en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C.
   5. Añadir 15 μL de la solución de colorante (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo e incubar durante 4 h en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C, y luego añadir 100 μL de solución de solubilización/parada (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo e incubar durante la noche en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C.
   6. Mida la densidad óptica a 570 nm (OD₅₇₀) utilizando un lector de microplacas (consulte la tabla de materiales). Prepare de 6 a 12 réplicas y repita los experimentos al menos tres veces.
   7. Utilice software estadístico (ver Tabla de Materiales) para trazar gráficamente estos datos como un gráfico semi-logarítmico y calcular el valor de IC₅₀, que es la concentración del fármaco que reduce la respuesta al 50% de su máximo (ver Tabla de Materiales).
2. Exposición continua de células PC-9 al irreversible EGFR-TKI, afatinib, mediante un aumento gradual de la dosis en tres placas independientes de 10 cm
   1. Cultivo de células PC-9 en placas p100 que contienen 10 mL de medio de crecimiento. Cuando las células PC-9 alcancen la etapa subconfluente, transfiera 1 mL de suspensión celular a tres nuevas placas p100, con 9 mL de medio de crecimiento. Las células PC-9 diluidas 1:10 se vuelven subconfluentes en 3-4 días, con un número de células de aproximadamente 4-5 x 10⁵ células/mL.
   2. Al día siguiente, agregue 1/10 del valor IC₅₀ de afatinib en cada una de las tres placas p100.
      NOTA: El afatinib se reconstituye en DMSO a concentraciones de 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM y 5 mM. Se añaden de 1 a 10 μL de solución de afatinib en 10 mL de medio de crecimiento en el cultivo, según las concentraciones finales requeridas.
   3. Cuando las células de las placas de p100 que contienen afatinib se vuelvan subconfluentes, mezcle bien por aspiración con una pipeta de 1 mL y agregue 1 mL de la suspensión celular a 9 mL de medio de crecimiento fresco en una nueva placa de p100. A continuación, agregue concentraciones 10-20% más altas de afatinib al nuevo cultivo.
   4. Aumentar la concentración de afatinib de 0,1 nM a 1 μM en el medio mediante el aumento gradual de la dosis con la concentración de afatinib aumentada en un 10-20% en cada paso durante el período de 10-12 meses.
      nota: Cuando la concentración de afatinib se acerca al valor IC₅₀, el crecimiento celular se vuelve bastante lento. Si las células se dividen 1:9, es posible que no crezcan, ya que estas células son eliminadas por concentraciones más altas de afatinib. Por lo tanto, a concentraciones más altas de afanitib, las células se pueden dividir en una proporción de 1:2. Las células más resistentes se cultivaron en un medio que contenía afatinib durante 3 a 14 días, y el medio no se modificó hasta que fue necesario pasar las células resistentes.
   5. Cultive las células resistentes a afatinib durante 2-3 meses en un medio de crecimiento que contenga afatinib de 1 μM. A una concentración de afatinib de 1 μM, se requieren de 10 a 12 meses para desarrollar resistencia a afatinib en este modelo. Realice el ensayo MTT para confirmar que las células son resistentes al afatinib. Las tres líneas celulares de resistencia a afatinib establecidas de forma independiente se denominaron AFR1, AFR2 y AFR3.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
FBS	gibco	26140-079
Estreptococo de la pluma	gibco	Números 15140-163
placa de 10 cm tratada con cultivo celular	Violamo	2-8590-03
afatinib	Selleck	S1011
Microplaca de 96 pocillos	termo	130188
CellTiter 96	Promega	G4100	ensayo de proliferación de células no radiactivas; Solución de colorante y solución de solubilización/parada
Espectrofotómetro NanoDrop Lite	termo	Na	espectrofotómetro
Software GraphPad Prism v.7	GraphPad, Inc.	Na	Un software estadístico
Dmso	Wako	043-07216