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1. Preparación de muestras de tejido tumoral
- Fije el tejido tumoral en formol tamponado neutro (NBF) al 10% en un casete.
nota: El tejido tumoral de los tumores de pulmón proximal generalmente se obtiene mediante broncoscopia, realizada bajo sedación moderada por un neumólogo o un especialista en pulmones. Para lesiones periféricas y enfermedad pulmonar difusa, está indicada una biopsia transbronquial o con aguja. Estos procedimientos generalmente se realizan en una sala de cirugía o en una unidad de cuidados intensivos.
- Incruste el casete en paraffin.
nota: La fijación se puede lograr por perfusión o inmersión inmediatamente después de la disección y, por lo general, requiere de 8 a 10 h. El volumen del fijador debe ser de 15 a 20 veces mayor que el volumen de la muestra. No se recomienda fijar el tejido de la biopsia durante más de 10 h, ya que la sobrefijación puede causar el enmascaramiento del antígeno. La velocidad de fijación es de aproximadamente 1 mm/h a temperatura ambiente.
- Infiltrar la muestra de tejido fijada con cera en el procesador de tejidos (ver Tabla de Materiales).
nota: La deshidratación se realiza en tres baños de alcohol con concentraciones crecientes de 70%, 85% y 90%. Finalmente, el agua se elimina mediante tres baños finales de alcohol absoluto. El aclarado se realiza en tres baños de tolueno y la infiltración de cera en baños de cera caliente (44-60 °C).
- Incruste el tejido dentro de un molde lleno de parafina fundida (consulte la Tabla de materiales) y espere a que se solidifique.
- Seccionar el tejido embebido en parafina con un grosor de 3 μm en un micrótomo.
- Transfiera la cinta de parafina a un portaobjetos de vidrio de microscopio cargado positivamente (consulte la Tabla de materiales).
- Seque el portaobjetos durante 1 h a 37 °C.
Nota: Almacene las secciones de tejido a una temperatura de 2 a 8 °C (preferiblemente) o a temperatura ambiente de hasta 25 °C para preservar la antigenicidad y teñir dentro de los 15 días posteriores al corte.
2. Preparación de muestras de citología
- Recoja los lavados bronquiales en una solución conservante (ver Tabla de Materiales).
nota: Para ello, se utiliza la técnica broncoscopia estándar.
- Lavar la distribución del bronquio que se va a muestrear. Recoja la colada en un recipiente limpio. Etiquete el envase con el nombre y apellido del paciente, la fecha de nacimiento y la fuente de la muestra.
- Transfiera los lavados bronquiales a un tubo cónico de 50 mL y agregue 2 g de DL-Ditiothreitol en polvo (consulte la tabla de materiales), agite el tubo durante 30 minutos y luego centrifugue a 250 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Retirar el sobrenadante y añadir 10 mL de una solución mucolítica (ver Tabla de Materiales).
- Agitar la muestra durante 20 min a velocidad media (nivel 9) y centrifugarla a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante y deposite el pellet de la célula en tubos de recolección que contengan un 10% de NBF.
- Añada 4 gotas de un reactivo de preparación de bloques celulares (consulte la Tabla de materiales) al pellet de celdas.
- Transfiera el pellet de celda a un casete, fíjelo en NBF al 10% e incorpórelo en parafina para la preparación y el corte del bloque de celdas (consulte los pasos 1.1 a 1.7).