Ensayo de formación de colonias: evaluación de la eficacia de los agentes anticancerígenos en las células de cáncer de pulmón formadoras de colonias

Resumen

Fuente: Lee, J. Y.et al, Evaluación preclínica de la bioactividad de la cumarina anticancerígena OT48 mediante esferoides, ensayos de formación de colonias y xenoinjertos de pez cebra.J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe el ensayo de formación de colonias, que ayuda a determinar la capacidad de las células de cáncer de pulmón para proliferar indefinidamente y formar colonias individuales. Podemos analizar el efecto de un agente anticancerígeno sobre las células formadoras de colonias mediante el análisis de los cambios en el número y/o tamaño de las colonias resultantes.

Protocolo

1. Ensayos de formación de colonias

1. Cultivo de células A549 a una concentración de 20.000 células/^cm2 en 15 mL de medio de cultivo celular RPMI1640 suplementado con 10% de FBS (Suero Fetal Bovino) y 1% de antibióticos en un matraz de 75^cm2 en una incubadora de CO₂ a 37 °C y 5% de CO₂.
2. El día del experimento, determine la concentración de células mediante el uso de un hemocitómetro. Recoja 50.000 células por centrifugación a 400 x g durante 7 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y vuelva a suspender las células en 100 μL de 1x solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en tubos de 1,5 mL.
3. Dispensar 1,1 mL de medio semisólido a base de metilcelulosa (MCBM) en tubos de 15 mL con una multipipeta. Prepare un tubo para cada afección.
4. Añada 110 μL de FBS a 1,1 mL de MCBM con una micropipeta P200.
5. Siembra células a 1.000 células/mL. Recoja 2,4 μL de suspensión celular de la solución madre (50.000 células en 100 μL de 1x PBS) utilizando una micropipeta P2 y agregue 1,1 mL de MCBM suplementado con 10% de FBS.
6. Después de agregar las celdas, agite los tubos durante 1 minuto, sosteniéndolos verticalmente a la velocidad más alta para mezclar bien el MCBM y las celdas.
7. Añada compuestos de prueba (OT48 solo o en combinación con A1210477). Prepare un tubo separado como control para el solvente utilizado (en este caso, dimetilsulfóxido (DMSO)). En función de la concentración de los compuestos y del volumen añadido para cada condición, el control del disolvente incluirá la concentración más alta de disolvente utilizada para las diluciones del compuesto de ensayo, con el fin de evaluar los efectos adversos causados por el disolvente.
8. Tubos de vórtice durante 1 minuto.
9. Para cada ensayo, agregue 1 ml de la mezcla con una micropipeta P1000 al pocillo central de una placa de cultivo celular de 12 pocillos.
10. Llene los pozos vacíos con 1 ml de agua estéril o 1x PBS para estabilizar la humedad.
11. Incubar placas de cultivo durante 10 días en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂
12. Después de 10 días de incubación, agregue 200 μL de una solución madre de MTT (bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio) (5 mg/mL) a cada pocillo para alcanzar una concentración final de 1 mg/mL.
13. Incubar 10 min en una incubadora a 37 °C y 5% de_CO2. Las colonias viables se volverán violetas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biooeste	S1520-500	-20 C°
Penicilina-Estreptomicina	Lonza	17-602E	-20 C°
matraz para cultivo celular T75	Spl	70075	Rt
Solución PBS	Hyclone	SH30256.02	Rt
Tubo de 1,5 ml	Extragénico	Tubo-170-C	Rt
Tubo de 15 ml	Hyundai Micro	H20015	Rt
Placa de 12 pocillos	Spl	30012	Rt
MethoCult	Tecnologías StemCell	4230	-20 C°
Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (polvo de MTT)	sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies (en inglés)		Rt