Ensayo de xenoinjerto de pez cebra: un método para evaluar la eficacia anticancerígena de las terapias sobre la tumorigénesis en el pez cebra in vivo

Resumen

Fuente: Lee, J. Y et al.,Evaluación preclínica de la bioactividad de la cumarina anticancerígena OT48 mediante esferoides, ensayos de formación de colonias y xenoinjertos de pez cebra.J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe el ensayo de xenoinjerto de pez cebra para evaluar la formación de tumores in vivo y estudiar el efecto de los agentes terapéuticos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Ensayo de xenoinjerto de pez cebra

NOTA: Este enfoque técnico se visualiza como un esquema (Figura 1).

1. Preparación de reactivos madre
   1. Prepare 1 L de 30x solución de Danieau: 1740 mM de NaCl, 21 mM de KCl, 12 mM de MgSO₄•7H2O, 18 mM de Ca(NO₃)₂ y 150 mM de HEPES. Ajuste el pH del tampón a 7,6 con un medidor de pH.
   2. Prepare una solución de tricaína al 1% (50x): Disuelva 20 mg de 3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (tricaína) en 2 mL de agua destilada.
   3. Prepare la solución de Fenol Red-PBS al 1%: Agregue 2 μL de solución de sal sódica Phenol Red a 198 μL de solución de PBS esterilizada en un tubo de 1,5 μL.
   4. Preparar metilcelulosa al 3%: Añadir 3 g de metilcelulosa a 100 mL de 1x solución de Danieau.
2. Producción e incubación de huevos de pez cebra
   1. Separe una hembra y un macho de pez cebra en un tanque divisor lleno de agua del grifo esterilizada y filtrada con rayos UV a 28,5 °C en la oscuridad. Después de 24 h de separación, mezcle peces de ambos sexos para iniciar el apareamiento. Transfiera los huevos fertilizados del tanque de apareamiento a una placa de Petri que contenga 5 mL de solución fresca de Danieau.
   2. Lavar los huevos tres veces con 5 ml de la solución de Danieau. Para el lavado, aspire cuidadosamente los huevos con una pipeta y transfiéralos a 5 mL de solución fresca. Incubar durante 8 h a 28,5 °C.
      1. Después de 8 h de incubación en la solución de Danieau, cambie a la solución de Danieau que contiene 0,03% de 1-fenil-2-tiourea (PTU) para inhibir la pigmentación. Separe los óvulos opacos (no fertilizados o que contengan embriones no desarrollados) para evitar la contaminación.
3. Decorionación embrionaria
   1. 24 h después de la fertilización (HPF), descorionar embriones de pez cebra con pinzas afiladas. Incubar los embriones para incubar en la solución de Danieau con 0,03% de PTU a 28,5 °C hasta 48 hpf.
4. Preparación de células tratadas con compuestos
   1. Siembre las células A549 a 20.000 células/cm2 en matraces de cultivo de 25^cm2. Después de 24 h de siembra, añadir compuestos (aquí OT48 a 50 μM y/o A1210477 a 20 μM) durante 24 h en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Establezca el tiempo de tratamiento para cada compuesto para mantener la viabilidad de las células, pero para comprometerlas con la muerte celular. Este punto de tiempo debe configurarse individualmente en función de la viabilidad celular, la morfología y los marcadores moleculares.
   3. 2 h antes del final del tratamiento, teñir las células con 4 μM de colorante fluorescente CM-Dil a 37 °C y 5% de CO₂. Después de 2 h de incubación, tripsinizar las células con tripsina-EDTA al 0,05% y diluir 106 células en 50 μL de solución de fenol Red-PBS antes de la inyección.
5. Microinyección de células cancerosas para la formación de xenoinjertos
   1. Anestesiar al pez cebra en una solución de tricaína al 0,02% durante 5 minutos hasta que se asiente en una placa de agar.
   2. Tire de un capilar de vidrio de 1,0 mm (diámetro exterior [OD]) con un extractor de micropipetas (Ajustes de programa: P: 300, Calor: 260, Tirón: 60, VEL: 50 y Tiempo: 200). Corta el microcapilar con una jeringa para producir un borde afilado. Cargue los microcapilares con 20 μL de solución de Red-PBS de célula/fenol. Ajuste la presión de inyección y el tiempo para dispensar 2 nL por inyección.
   3. Inyecte de 100 a 200 células en el saco vitelino inyectando de 6 a 10 nL mediante 3 a 5 inyecciones. Después de la inyección, deje que los peces se recuperen durante 10 a 30 minutos en 5 ml de solución fresca de Danieau que contiene solución de PTU. Despachar los peces en placas de 24 pocillos con 1 mL de solución de Danieau que contenga solución de PTU e incubar durante 72 h a 28,5 °C.
   4. Después de 72 h de incubación, anestesiar a los peces en una solución de tricaína al 0,02% e inmovilizarlos en un portaobjetos de vidrio con una gota de metilcelulosa al 3%. Tome imágenes 5x por microscopía de fluorescencia a una longitud de onda de 620 a 750 nm.
   5. Cuantifique el tamaño de los tumores fluorescentes mediante el software ImageJ. Seleccione el menú "Analizar | Medida". Guarde los valores correspondientes a la señal fluorescente y analícelos con un software de estadísticas para la representación gráfica.

Resultados

Figura 1: Diagrama esquemático del proceso general del ensayo de xenoinjerto de pez cebra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biooeste	S1520-500	-20 C°
Penicilina-estreptomicina	Lonza	17-602E	-20 C°
matraz para cultivo celular T25	Spl	70025	Rt
matraz para cultivo celular T75	Spl	70075	Rt
Matraz para cultivo celular T175	Spl	71175	Rt
Tubo de 1,5 ml	Extragénico	Tubo-170-C	Rt
Placa de 24 pocillos	Spl	30024	Rt
Petridish	Spl	10100	Rt
Solución PBS	Hyclone	SH30256.02	Rt
Tripsina-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	71382	Rt
Cloruro de potasio (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	Rt
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	Rt
Nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	Rt
Solución HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Rt
3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (tricaína)	Sigma-Aldrich	E10521	Rt
Solución de rojo de fenol	Sigma-Aldrich	P0290	Rt
Metilcelulosa	Sigma-Aldrich	M0512	Rt
1-fenil-2-tiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Rt
Tinte CM-Dil	Invitrogen	C7001	-20 C°
Capilar de vidrio	Instrumentos de precisión mundial	TW 100F-4	Rt
Extractor de micropipetas	Instrumento de obturador, EE. UU.	P-97	Rt
Micro inyector	Instrumentos de precisión mundial	PV820	Rt
jeringa	KOVAX	1 ml	Rt
Micro cargador	Eppendorf	5242956003	Rt
Corredera de vidrio	Marienfeld	HSU-1000612	Rt
Microscopía de fluorescencia	Leica	DE/DM 5000B	Rt