1. Síntesis de ácido hialurónico-ceramida (HACE)
- Solubilizar 12,21 mmol de oligómero de ácido hialurónico (HA) y 9,77 mmol de hidróxido de tetra-n-butilamonio (TBA) en 60 ml de agua bidestilada (DDW). Revuelve durante 30 min.
- Para sintetizar el enlazador DS-Y30, disuelva 8,59 mmol de ceramida DS-Y30 y 9,45 mmol de trietilamina en 25 ml de tetrahidrofurano (THF). Mezclar con 8,59 mmol de cloruro de 4-clorometilbenzoilo en THF. Remover durante 6 horas a 60 °C.
- Disuelva los 8,10 mmol sintetizados de HA-TBA y los 0,41 mmol del enlazador DS-Y30 en una mezcla de THF y acetonitrilo (4:1, v/v). Remover durante 5 horas a 40 °C.
- Elimine las impurezas filtrando con un agente filtrante y elimine el solvente orgánico por evaporación al vacío. Purificar el producto utilizando una membrana de diálisis (punto de corte de peso molecular: 3,5 kDa) y liofilizar.
2. Preparación de las nanopartículas
- Disuelva 1 mg de HB y 1 mg de paclitaxel en 0,5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y mezcle con 0,5 ml de DDW mediante mezcla en vórtice durante 5 min. A continuación, solubilice HACE en esa mezcla mediante una mezcla en vórtice durante 5 minutos más.
- Para eliminar el disolvente, calentar a 70 °C durante 4 horas bajo un suave chorro de gas nitrógeno.
- Vuelva a suspender la película compuesta por HACE, HB y paclitaxel con 1 ml de DDW. Filtre con un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,45 μm) para eliminar los fármacos no encapsulados.
3. Fototoxicidad in vitro
- Absorción de nanopartículas en líneas celulares de cáncer de pulmón
- Prepare el medio RPMI-1640 que contiene 10% (v/v) de suero fetal bovino y 1% (p/v) de penicilina-estreptomicina.
- Siembre células A549 en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de 1 × 105 células/pocillo (triplicado para cada grupo). Incubar durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 y 95% de aire.
- Después de la fijación de las células, retire el medio y lave las células añadiendo 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Disolver las nanopartículas en PBS hasta una concentración final de 2 μM/ml HB. A continuación, incube las células con 1 ml de PBS, NP vacías, HB-NP o HB-P-NP en cada pocillo durante 4 horas en la oscuridad.
- Retire toda la solución y lave las células agregando 1 ml de PBS frío. Repita el paso de lavado una vez más. Agregue un medio de cultivo fresco.
- Ensayo de viabilidad celular
- Coloque la placa de cultivo celular debajo de la fibra PDT (con 1 cm de distancia desde la fibra PDT hasta el pocillo). Use gafas de seguridad láser e ilumine las celdas con un láser PDT (630 nm, 400 mW/cm2) en la oscuridad durante varios períodos de tiempo: 0, 5, 10, 20, 30 y 40 segundos (0, 2, 4, 8, 12 y 16 J/cm2). Luego, incube las células durante 24 horas en la oscuridad.
- Aspirar el medio y lavar las células añadiendo 1 ml de PBS frío. Repita el paso de lavado una vez más.
- Añada 10 μl de solución de medición de citotoxicidad a cada pocillo. Incubar en la oscuridad durante 2 horas.
- Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
