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Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Síntesis de ácido hialurónico-ceramida (HACE)
- Solubilizar 12,21 mmol de oligómero de ácido hialurónico (HA) y 9,77 mmol de hidróxido de tetra-n-butilamonio (TBA) en 60 ml de agua bidestilada (DDW). Revuelve durante 30 min.
- Para sintetizar el enlazador DS-Y30, disuelva 8,59 mmol de ceramida DS-Y30 y 9,45 mmol de trietilamina en 25 ml de tetrahidrofurano (THF). Mezclar con 8,59 mmol de cloruro de 4-clorometilbenzoilo en THF. Remover durante 6 horas a 60 °C.
- Disuelva los 8,10 mmol sintetizados de HA-TBA y los 0,41 mmol del enlazador DS-Y30 en una mezcla de THF y acetonitrilo (4:1, v/v). Remover durante 5 horas a 40 °C.
- Elimine las impurezas filtrando con un agente filtrante y elimine el solvente orgánico por evaporación al vacío. Purificar el producto utilizando una membrana de diálisis (punto de corte de peso molecular: 3,5 kDa) y liofilizar.
2. Preparación de las nanopartículas
- Disuelva 1 mg de HB y 1 mg de paclitaxel en 0,5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y mezcle con 0,5 ml de DDW mediante mezcla en vórtice durante 5 min. A continuación, solubilice HACE en esa mezcla mediante una mezcla en vórtice durante 5 minutos más.
- Para eliminar el disolvente, calentar a 70 °C durante 4 horas bajo un suave chorro de gas nitrógeno.
- Vuelva a suspender la película compuesta por HACE, HB y paclitaxel con 1 ml de DDW. Filtre con un filtro de jeringa (tamaño de poro de 0,45 μm) para eliminar los fármacos no encapsulados.
3. Eficacia anticancerígena in vivo en ratones portadores de tumores
- Modelo de ratón inducido por cáncer de pulmón
- Prepare 1 × 106 pilas A549 en medio RPMI-1640 de 0,1 ml; manténgalo en hielo.
- Anestesiar a los ratones con una inyección i.p. de una xilacina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
nota: Si no se observa ningún movimiento, el animal está lo suficientemente anestesiado como para iniciar los experimentos.
- Inyecte las células por vía subcutánea en el flanco izquierdo de ratones desnudos machos BALB/C (6 a 7 semanas de edad, 20 a 22 g).
- Sigue observando a los ratones hasta que empiecen a moverse por la jaula.
nota: No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Mantenga a los ratones en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).
- Mida el tamaño del tumor con pinzas todos los días. Calcule el volumen tumoral (mm3) como (largo × ancho2) / 2. Cuando el tamaño del tumor alcance aproximadamente 200mm3 de volumen, inicie el experimento.
- Estudio de eficacia contra el cáncer
- Divida aleatoriamente los ratones en 4 grupos (n = 10 para cada grupo).
- Anestesiar a los ratones con una inyección i.p. de una xilacina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
nota: Si no se observa ningún movimiento, el animal está lo suficientemente anestesiado como para iniciar los experimentos.
- Disolver las nanopartículas en PBS hasta una concentración final de 2 mg/ml de HB. Inyecte PBS, HB libre, HB-NPs o HB-P-NPs a través de la vena de cola (2 mg/kg como HB) dos veces en los días 0 y 7.
- Sigue observando a los ratones hasta que empiecen a moverse por la jaula.
nota: No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. Mantenga las jaulas oscuras y bajo condiciones específicas de SPF.
- 24 horas después de cada inyección, anestesiar a los ratones con una inyección i.p. de una xilacina y una mezcla de tiletamina y zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente un pequeño pliegue de piel de ratón. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
nota: Si no se observa ningún movimiento, el animal está lo suficientemente anestesiado como para iniciar los experimentos.
- Coloque el sitio del tumor debajo de la fibra PDT (con 1 cm de distancia desde la fibra PDT hasta el tumor). Use gafas de seguridad láser, apague el interruptor e ilumine el tumor con un láser PDT (630 nm, 400 mW/cm2) durante 500 segundos (200 J/cm2) dos veces los días 1 y 8.
- Sigue observando a los ratones hasta que empiecen a moverse por la jaula. No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Mantenga las jaulas en condiciones de SPF. Mantenga las jaulas en la oscuridad durante 24 horas después del tratamiento con láser.
- Controle visualmente el volumen del tumor y los cambios en el sitio del tumor todos los días. Mida el tamaño del tumor con calibradores y calcule el volumen como (largo × ancho2) / 2 (mm3). Tome imágenes de los sitios tumorales todos los días para verificar si hay alteraciones en la superficie del tumor después de la TFD.
- El día 16, sacrificar cinco ratones por grupo con anestesia terminal con isoflurano.
- Con pinzas y tijeras, corte la piel exterior y exponga los tumores. Coseche con cuidado. Fijarlos en formol al 10%, incrustarlos en parafina y teñirlos con hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis histológico.
- Después de 45 días de monitoreo, sacrifique los ratones restantes con anestesia terminal con isoflurano.