Instilación y fijación pulmonar: introducción de líquido en la tráquea y fijación de los pulmones para medir el volumen pulmonar fijado

Resumen

Fuente: Limjunyawong, N. et al, Métodos de instilación y fijación útiles en la investigación del cáncer de pulmón en ratones. J. Vis. Exp. (2015).

Este video describe un método simple y confiable de introducir líquido en la tráquea para la instilación pulmonar, la fijación y la medición del volumen pulmonar.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Instilación pulmonar

1. Seleccione una cánula intravenosa comercial de 20 g de una pulgada de largo para usar en la intubación.
2. Modifique la punta del catéter manualmente, doblándola para generar una ligera curvatura en la punta, como se ilustra en la Figura 1.
3. Anestesiar al ratón con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (15 mg/kg) inyectada IP, y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo. Aplique ungüento veterinario en los ojos inmediatamente después de la anestesia. Inmediatamente después de la anestesia, aplique ungüento veterinario en los ojos y administre carprofeno (5-10 mg/kg sq) para la analgesia postquirúrgica y de instilación.
4. Coloque al ratón en posición supina sobre una plataforma inclinada. Como se muestra en la Figura 2, una carpeta de oficina grande con bucles de sutura pegados con cinta adhesiva funciona perfectamente bien.
5. Afeitar la parte ventral del cuello y limpiar y desinfectar la zona del cuello con alcohol al 70%. Con los nuevos guantes sin látex ni polvo, utilizar instrumental quirúrgico desinfectado con alcohol al 70%.
6. Con unas tijeras afiladas, realice una pequeña incisión quirúrgica en el cuello aproximadamente 12 mm por debajo del incisivo inferior.
7. Con una pinza, tire suavemente de la piel del cuello caudalmente hasta que se pueda ver la pared ventral de la tráquea.
8. Retraiga suavemente la lengua e inserte la cánula con la punta doblada inclinada hacia la superficie ventral del ratón. Al igual que en 1.4, tire suavemente de la piel del cuello e inserte la cánula en la tráquea.
   nota: Con un poco de práctica, el catéter será visible moviéndose por la tráquea. Si se coloca en el esófago, no habrá visión visual del movimiento del catéter. No se hacen incisiones en la tráquea.
9. Una vez que se ve el catéter en la tráquea del cuello, se avanza unos 5 mm para que pase de forma fiable las cuerdas vocales pero aún muy por encima de la carina.
10. Prepárese para instilar hasta 50 μl de líquido inyectando a través del catéter con una punta de pipeta de carga de gel. Coloque la punta en el buje luer, pero antes de inyectar observe cuidadosamente el movimiento del líquido en la punta sincrónico con la respiración del ratón. A continuación, inyecte el instilado.
11. Con una jeringa de 1 ml, realice inmediatamente un inflado relativamente rápido de 0,6 ml de aire en los pulmones a través del catéter para ayudar a distribuir el líquido profundamente en los pulmones. Retire la cánula.
12. Retire la cánula.
13. Utilice una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato para cerrar la pequeña herida quirúrgica según las instrucciones del prospecto de VetBond. Coloque a los ratones en jaulas individuales y vigílelos visualmente hasta que se despierten y se comporten normalmente sin ningún indicio de incomodidad.

>2. Medición del volumen pulmonar fijo

1. Mida el volumen pulmonar utilizando el principio de Arquímedes, como se ilustra en la Figura 3. Retire el pulmón fijado del formaldehído y diseccione el corazón y cualquier otro tejido no pulmonar.
2. Use un dispositivo de soporte de alambre casero simple previamente construido que se usa para mantener los pulmones completamente bajo el agua.
   nota: Este dispositivo debe ser compatible con la balanza que se esté utilizando. Un dispositivo típico que se muestra en la Figura 4 está hecho de pipetas de plástico y alambre delgado (20 G). Este sistema funciona bien con la balanza utilizada en el vídeo, pero podría adaptarse fácilmente a la mayoría de las balanzas de laboratorio.
3. Coloque un vaso de precipitados con ≈200 ml de agua en la balanza y tara con la jaula de soporte en su lugar en el agua. Véase la figura 5. Retire la jaula de metal; Coloque el pulmón en la superficie del agua y presione bajo el agua con la jaula.
4. Registre el peso en la balanza. Este número refleja el volumen de agua desplazada y, por lo tanto, es una medida directa del volumen pulmonar. Tenga cuidado de asegurarse de que el pulmón o la sutura o cualquier parte de la jaula de alambre no toque los lados o la parte inferior del vaso de precipitados.
5. Para mayor precisión, repita esta medición. Retire el pulmón del agua y séquelo en un pañuelo de papel. Vuelva a colocar el vaso de precipitados con la jaula en su lugar y repita la medición del volumen pulmonar. A continuación, se deben promediar las dos mediciones de volumen.
   nota: Si los pulmones se dejan en la formalina durante más de una semana, el aire de los pulmones se disolverá en el líquido. Cuando esto sucede, el pulmón se hundirá, por lo que ya no es necesario utilizar ningún dispositivo como en la Figura 4 para mantener el pulmón sumergido. En tal caso, el volumen se puede medir simplemente sujetando el pulmón por una de las cuerdas de sutura hasta que quede completamente sumergido, como se ilustra en la Figura 3.

Resultados

Figura 1: Catéter intravenoso con punta ligeramente curvada utilizado para la instilación.

Figura 2: Aglutinante inclinado de 3 anillos utilizado para sostener ratones para la intubación. Este aglutinante está configur...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Balanza de laboratorio	Ohaus	Adventurer Pro Modelo AV 313	Se pueden utilizar otras balanzas si tienen un rango de 1 a 300 g
Catéter intravenoso Luer de 20 g	Insylte		Varios otros posibles proveedores, por ejemplo, Jelco Optiva
Frasco de laboratorio de 500 ml	varios		Varios otros posibles proveedores