Artículo de método
La fabricación de los canales de microfluidos y su aplicación en los experimentos para estudiar el comportamiento quimiotáctico de alimentación de los microbios marinos dentro de un paisaje marino irregular de nutrientes y el comportamiento de la natación de las bacterias dentro del flujo de corte se describen.
El grado en que los microbios planctónicos pueden explotar los parches de la microescala de recursos tendrán una repercusión importante en trofodinámica oceánica y el flujo de bioquímicos. Sin embargo, para tomar ventaja de los parches de nutrientes en el océano, los microbios de natación deben superar las influencias de las fuerzas físicas como la difusión molecular y turbulenta corte, lo que limitará la disponibilidad de parches y la capacidad de las bacterias para localizarlos. Hasta hace poco, las limitaciones metodológicas han impedido exámenes directos del comportamiento microbiano en los hábitat irregulares y realista a pequeña escala las condiciones de flujo. Por lo tanto, gran parte de nuestros conocimientos actuales sobre el comportamiento microbiano en el océano ha sido obtenida a partir de las predicciones teóricas. Para obtener nueva información sobre el comportamiento de forrajeo de microbios en el océano se han aplicado las técnicas de fabricación suave litográfica para desarrollar dos dispositivos de microfluidos, que hemos utilizado para crear (i) micro nutrientes parches con las dimensiones y características difusivas relevante para los procesos oceánicos y microescala (ii) vórtices, con tasas de corte correspondiente a los esperados en el océano. Estos dispositivos de microfluidos, han permitido un primer examen directo de la natación microbianas y el comportamiento quimiotáctico dentro de un paisaje marino heterogéneo y dinámico. El uso combinado de epifluorescencia y microscopía de contraste de fase permite exámenes directos de las dimensiones físicas y las características difusivas de los parches de nutrientes, mientras que la observación de la respuesta de agregación a nivel de población, además de la conducta de nado de los microbios individuales. Estos experimentos han revelado que algunas especies de fitoplancton, bacterias y protistas heterótrofos phagotrophic son expertos en localizar y explotar la difusión de los parches de los recursos de la microescala, en plazos muy cortos. También se ha demostrado que hasta las moderadas tasas de corte, las bacterias marinas son capaces de luchar contra la corriente y nadar a través de su entorno a su propia voluntad. Sin embargo, más allá de un umbral de corte de alta, las bacterias se alinean en el flujo de tensiones y son menos capaces de nadar sin interrupción de la corriente. Microfluídica representa un enfoque novedoso y de bajo costo para el estudio de la ecología microbiana acuática, y debido a su idoneidad para la creación de campos con precisión realista del flujo y los gradientes de sustrato en la microescala, es ideal aplicable a los exámenes del comportamiento microbiano en las escalas más pequeñas de la interacción. Por lo tanto, sugieren que la microfluídica representa una herramienta valiosa para la obtención de una mejor comprensión de la ecología de los microorganismos en el océano.
Preparación
1. Crear una máscara
El uso de un software de CAD, el diseño del canal de alta resolución de impresión en una transparencia. Esta será la "máscara".
En la sala limpia:
2. Limpia y hornear la hostia
En primer lugar, chorro de la oblea con acetona, y rápidamente con metanol, y luego con isopropanol. Por último, secar la oblea con nitrógeno.
Hornee la oblea en el horno (130 ° C) durante 5 min.
3. Revestimiento de la oblea
Lugar de la oblea en el centro de la máquina de spin-coating. Vierta fotosensible (SU-8) de la botella sobre la oblea. Deja que el flujo de SU-8 y relajarse durante unos 10 s. A su vez en el spin-aplicador y la rampa de la velocidad de aceleración de 0 a 500 rpm durante 5 s; mantener a 500 rpm durante 10 s; la rampa hasta la velocidad final de más de 10 s, y mantener a la velocidad final de 30 s. La velocidad final depende del espesor del recubrimiento blanco y el SU-8 utilizados. Los detalles se pueden encontrar en http://www.microchem.com/
4. Soft-cocer al horno
Después del recubrimiento de la oblea, se hornea primero a 65 º C y luego a 95 ° C. El tiempo de cocción varía con el espesor objetivo y el tipo de fotoprotector utilizado. A continuación, que la oblea reposar a temperatura ambiente durante al menos 5 min.
5. Exposición
Coloque la máscara en la parte superior de la oblea y exponer la hostia a la luz ultravioleta durante el tiempo recomendado en el SU-8 manual.
6. Después de la exposición hornear
Hornee la oblea a 65 ° C y 95 ° C después de la SU-8 manual instrucciones.
7. El desarrollo de la oblea para obtener el "maestro" (moho)
Prepare un vaso lleno con el desarrollador (PMMA). Sumerja la oblea en el vaso, mientras que muy suavemente oscilantes el vaso hasta que la parte expuesta de la fotosensible es eliminada.
En nuestro laboratorio:
8. Prepare PDMS y se vierte sobre la oblea
Mezclar el PDMS con su agente de curado en relación 10:1 en una taza. Revolver y mezclar homogéneamente: esto va a generar muchas burbujas y hacer la mezcla de mirada opaca. Vierta la mezcla sobre el "maestro".
9. De la burbuja en la cámara de vacío
Para eliminar las burbujas, coloca la mezcla principal y PDMS que es lo que cubre en una cámara de vacío hasta que todas las burbujas se han ido.
10. Hornear en horno
Hornear durante al menos 12 horas en un horno a 65 ° C para endurecer el PDMS.
11. Hacer agujeros
Despegue el PDMS del maestro y agujeros para entradas y salidas de los canales.
En salas blancas (no se muestra)
12. Plasma la unión
Canales se unen a un portaobjetos de vidrio, después de tratar tanto la capa de PDMS y la lámina de vidrio con plasma de oxígeno durante 1 min.
Experimentos:
Exp N º 1: Análisis de la respuesta quimiotáctica de los microbios marinos a micro-escala de las capas de nutrientes
1) Configuración del experimento
2) Ejecución del experimento
Exp N º 2: Investigar los efectos de la corte sobre las bacterias marinas nadando en un vortexZ
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Una comprensión de cómo los microbios marinos interactúan con sus productos químicos locales y el medio ambiente físico es imprescindible para una percepción más completa y precisa del papel de los microorganismos del plancton en los océanos y los nutrientes de carbono de ciclos (Azam y Malfatti 2007). Sin embargo, debido a las pequeñas escamas (mm <) sobre el cual muchas de las interacciones microbianas importantes tienen lugar, las limitaciones técnicas han impedido que los exámenes detallados del comportamiento microbiano dentro del h...
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Nos gustaría dar las gracias Microsystems Technology Laboratories en el MIT por permitirnos filmar parte del video en las instalaciones de sala blanca.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS, Sylgard 184 | Kit de elastómero de silicona | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Fotolitográfica | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E microscopio invertido | Microscopio | Nikon Instruments | ||
| Tubo de PEEK (0,762 mm de diámetro interno, 1,59 mm de diámetro externo) | Herramienta | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Jeringas (punta Luer-Lok) | Herramienta | BD Biosciences | ||
| Conector Parte P-704-01 | Herramienta | Upchurch Scientific | Para conectar el tubo a jeringas con punta Luer-Lok | |
| Bomba de jeringa (PHD 2000 programable) | Equipo | Harvard Apparatus | ||
| Cámara CCD (PCO 1600) | Equipo | Cook |
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