Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de Jove
1. Preparación del equipo de trasplante y mesa de cirugía
NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse en autoclave, y la mesa de cirugía y los instrumentos deben desinfectarse con alcohol al 70%.
- Conecte un soporte de cabeza estereotáxico a la anestesia a través de una máscara nasal y encienda la almohadilla térmica.
- Conecte una jeringa Hamilton hermética al gas a un tubo de polietileno y una cánula de ojo de extremo romo.
nota: Se recomienda llenar todas las piezas con PBS antes del montaje. Compruebe si hay burbujas de aire atrapadas y retírelas si las hay.
- Fije la jeringa Hamilton firmemente a la mesa (Figura 1a) o a una base móvil (Figura 1e) y conecte el tubo al microscopio estereoscópico, con la cánula colgando hacia abajo (es decir, posición de espera).
nota: Use cinta quirúrgica, porque es fácil de quitar y volver a colocar.
- Prepare una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 30 g llena de 0,1 mg/kg de solución de buprenorfina.
- Prepare una jeringa con PBS estéril. También puede utilizar una pipeta.
- Ponga a un lado una jaula de despertador limpia con una lámpara de calefacción.
>2. Anestesia y posicionamiento de ratones receptores para cirugía
NOTA: Todos los animales fueron criados y mantenidos en un ambiente libre de patógenos en las instalaciones de animales de la Universidad de Lund.
- Anestesiar al ratón en una cámara llena de isoflurano al 40% de O2/60% N2/3% y transferir el ratón anestesiado a la plataforma del soporte de la cabeza en una almohadilla térmica tibia (Figura 1a). Compruebe la falta de reflejos pedales.
nota: La anestesia con isoflurano es el método preferido de anestesia para una recuperación rápida después de la cirugía. La sala del microscopio debe estar adecuadamente ventilada para usar isoflurano.
- Coloque el hocico del ratón en la máscara de anestesia conectada a la máquina de anestesia con isoflurano al 40%Ø2 /60% N2 0,9%–1,5%. Utiliza el pulgar y el dedo para levantar ligeramente la cabeza y sujetarla con las piezas metálicas de los laterales. Asegúrese de que los auriculares fijen la cabeza directamente debajo de las orejas. Inyectar 0,1 mg/kg de solución de buprenorfina por vía subcutánea en el dorso del ratón.
nota: La buprenorfina se utiliza como analgésico.
- Incline la cabeza de modo que el ojo que se va a operar quede hacia arriba y esté cerca del investigador.
- Retraiga suavemente los párpados del ojo que se va a trasplantar con pinzas romas, saque el ojo y fíjelo sin apretar con un par de pinzas. Asegúrese de que las puntas de las pinzas estén cubiertas con un tubo de polietileno unido a la plataforma del soporte de la cabeza (Figura 1a, recuadro).
- Mantenga siempre ambos ojos húmedos aplicando una gotita de PBS estéril sobre el ojo.
- Transfiera los islotes humanos del tubo sellado de 1,5 mL (sección 1) a una placa de Petri con PBS estéril y asegúrese de que los islotes estén cerca unos de otros para minimizar la cantidad de medios de cultivo celular transferidos (Figura 1c).
- Recoja ~ 20-30 islotes en la cánula ocular conectados a través de un tubo de polietileno a la jeringa Hamilton.
nota: Tome la menor cantidad de líquido posible con los islotes.
- Cuelgue el tubo boca abajo y conéctelo al microscopio estereoscópico (Figura 1d). Tape el tubo con cuidado para dejar que los islotes se hundan hasta el extremo del tubo hacia la cánula.
3. Procedimiento de trasplante
>NOTA: Este método ha sido descrito previamente para el trasplante de islotes de ratón. Aquí se presenta un procedimiento ligeramente modificado.
- Pellizca las almohadillas de las patas traseras para asegurarte de que el ratón esté dormido.
- Apriete las pinzas que sujetan el ojo sin interrumpir el flujo sanguíneo y aplique una gota de PBS estéril sobre el ojo.
- Con una aguja de 25 G como bisturí, biselar hacia arriba, penetrar con cuidado solo la mitad de la punta en la córnea y hacer una sola incisión lateral. Haz el agujero en un ángulo hacia arriba; el orificio se sellará más fácilmente después del trasplante (Figura 1f).
- Levante con cuidado la córnea con la cánula precargada de islotes y aplique lentamente los islotes en el ojo. Evite la inserción de la cánula en la cámara anterior para evitar daños en el iris, sino que empuje con cuidado contra la abertura corneal (Figura 1g). Retraiga lentamente la cánula del ACE.
nota: Trate de obtener un volumen de inyección de 3 a 8 μL. Si el volumen es demasiado grande, expondrá el ojo a una presión intraocular innecesariamente alta y puede provocar el reflujo de los islotes inyectados fuera de la cámara anterior.
- Cuando tenga dificultades con la inserción de los islotes debido al aumento de la presión en la cámara ocular, amplíe el sitio de la incisión reforzando el sitio de la incisión lateral y vuelva a aplicar los islotes><.
nota: Ocasionalmente, las burbujas de aire introducidas se pueden usar como soportes de espacio.
- Aplique gel ocular en el ojo, afloje las pinzas de contención ocular y deje al ratón con isoflurano en la misma posición durante 8 a 10 minutos para que los islotes se asienten.
- Retire las pinzas que sujetan el párpado y vuelva a colocar el párpado en su posición normal.
- Retire el mouse del soporte de la cabeza y transfiéralo a una jaula para despertar.
- Cuando el ratón esté despierto y en movimiento, transfiéralo de nuevo a la jaula original y manténgalo en el alojamiento del animal hasta que lo escanee (se recomiendan al menos 5 días).
