1. Cultivo de organoides y preparaciones antes de la electroporación
- Establecer organoides por digestión de tejidos como se describió anteriormente y expandirlos con su correspondiente medio de cultivo específico de la entidad en una matriz de basamento ver Tabla 1 y Tabla de Materiales
nota: En el caso de las muestras de tejido humano, es necesario el consentimiento informado y la aprobación del estudio por parte de un comité ético.
- Precaliente placas de 48 pocillos a 37 °C para la siembra posterior a la electroporación.
- Prepare medio basal sin antibióticos, así como medio de cultivo de organoides específicos de la entidad sin antibióticos (ver Tabla 1), incluyendo 10 μM Y-27632 y 3 μM CHIR99021.
nota: La retirada de los antibióticos es importante para reducir los efectos tóxicos. Y-27632 y CHIR99021 mejoran la recuperación celular.
- Preparación de los organoides (ver Figura 1)
- Cultivar 5 pocillos de organoides en una placa de 48 pocillos por muestra de electroporación en medio de cultivo.
nota: Se deben usar organoides proliferativos (alrededor de 2-3 días después de la última división).
- Prepare 230 μL de reactivo de disociación (consulte la Tabla de materiales), incluidos 10 μM Y-27632 por pocillo.
- Retire el medio de cultivo de cada pocillo y disocie los organoides mecánicamente en 230 μL de la mezcla de disociación preparada. Agrupe 5 pocillos por muestra de electroporación en un tubo de 15 mL.
- Mezclar por vórtice e incubar durante 5-15 min a 37 °C hasta que se formen grupos de 10-15 células. Por lo tanto, verifique la disociación microscópicamente. Detenga la digestión agregando medio basal sin antibióticos hasta 10 mL.
nota: ¡Este paso es muy crítico! La eficiencia de la electroporación se reducirá cuando la incubación sea demasiado corta, pero la digestión prolongada reducirá la supervivencia.
- Centrifugar a 450 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y lavar dos veces con 4 mL de tampón de electroporación (ver Tabla de Materiales).
>2. Electroporación
NOTA: Se desarrolla el siguiente protocolo para electroporadores capaces de ondas cuadradas y secuencias de pulsos de transferencia y poros separadas (ver Figura 2). Opcionalmente, los valores de impedancia, así como los voltajes, corrientes y energías transferidos a la muestra, se pueden medir como control para experimentos reproducibles.
- Vuelva a suspender el pellet de organoide en 100 μL de tampón de electroporación (ver Tabla de Materiales) que contenga 30 μg de ADN plasmídico.
nota: La concentración del ADN plasmídico utilizado debe superar los 5 μg/μL para obtener una concentración óptima de sal durante el proceso de electroporación. Por lo tanto, se recomiendan los kits de maxi plásmidos endolibres (ver Tabla de Materiales) para la preparación de vectores. Se puede utilizar una cantidad total de hasta 45 μg de ADN sin efectos citotóxicos.
- Dispense la mezcla completa de ADN y organoides en una cubeta de electroporación con un ancho de espacio de 2 mm sin producir burbujas de aire.
- Ajuste los parámetros de electroporación (consulte la Tabla 2, Figura 2).
- Mezcle las celdas ligeramente sin hacer espuma golpeando la cubeta con un dedo. Coloque la cubeta en la cámara de la cubeta.
- Presione el botón Ω del electroporador y anote el valor de impedancia.
nota: Una impedancia entre 30-40 Ω mostró los mejores resultados. En general, debe estar en el rango entre 30-55 Ω. Si este no es el caso, controle los siguientes aspectos: ancho de espacio de la cubeta utilizada, conexiones de cable del electroporador, posibles burbujas de aire, volumen correcto y concentración de sal de la mezcla de electroporación.
- Presione el botón Inicio para ejecutar el programa de electroporación y controlar los valores de corrientes, voltajes y energías mostrados><.
nota: Los valores de los voltajes, corrientes y energías medidos deben corresponder a los parámetros de electroporación establecidos. Para la comparación de experimentos repetidos, puede ser útil tener en cuenta estos datos.
- Después de la electroporación, agregue inmediatamente 500 μL de medio de cultivo sin antibióticos (con CHIR99021 e Y-27632; ver paso 1.3). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo para disociar la espuma blanca.
nota: La espuma blanca aparece después del proceso de electroporación y se le une un número significativo de celdas. Por lo tanto, la disociación de la misma es muy importante para no perder células.
- Transfiera la muestra completamente de la cubeta a un nuevo tubo de 15 mL utilizando la pipeta perteneciente a las cubetas de electroporación (ver Tabla de Materiales). Se recomienda enjuagar la cubeta nuevamente con medio basal para obtener las células restantes.
- Para la regeneración de las células, incubarlas durante 40 minutos a temperatura ambiente.
>3. Siembra de células
- Centrifugar las células a 450 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en 100 μL de matriz basal y siembre 20 μL en una placa precalentada de 48 pocillos (consulte el paso 1.2). Incubar durante 10 min a 37 °C para polimerización y añadir 250 μL de medio de cultivo, que se suplementa con Y-27632 y CHIR99021 hasta la siguiente división de los organoides cultivados (alrededor de 5-7 días).
>4. Determinación de la eficiencia de la transfección
NOTA: En general, se recomienda electropoar un vector portador de un marcador de fluorescencia como control de transfección adicional. Dependiendo del marcador elegido y de su maduración cromófora, la fluorescencia será visible alrededor de 24-48 h después de la transfección18.
- Comprobar la fluorescencia microscópicamente después de 24-48 h en el control de transfección (Figura 3B)
Tabla 1: Composición de medios basales, mezclas de digestión y medios de cultivo.
| Componentes del medio basal: | Yo | Ii |
| DMEM/F-12 avanzado | - | - |
| Glutamax | 1 vez | 1 vez |
| Hepes | 10 mM | 10 mM |
| Penicilina Estreptomicina | - | 1 vez |
| Primocina | 1 vez | - |
| Establecimiento por digestión |
| Mezcla de digestión: | dos puntos | Estómago | Hígado | Páncreas |
| normal | tumoral | normal | tumoral | normal | tumoral | normal | tumoral |
| Colagenasa II | - | - | - | - | - | 0.625 mg/ml |
| Colagenasa XI | - | 0,1 mg/ml | - | 0,1 mg/ml | - | - |
| Colagenasa D | - | - | - | - | 2.5 mg/ml | - |
| Dispasa II | - | 1 mg/ml | - | 1 mg/ml | - | 2.5 mg/ml |
| DNasa I | - | - | - | - | 0.1 mg/ml | - |
| EDTA | 2 mM | - | 10 mM | - | - | - |
| Diluido en | Tampón quelante* | Medio basal I | Tampón quelante* | Medio basal I | en EBSS | Medio basal I |
| Incubación para: | 0,5 h sobre hielo | 1h a 37°C | 0,25-0,5 h en RT | 1h a 37°C | 0,5-1 h a 37°C | 1,5 h a 37°C | 0,5-1 a 37 °C | 2-3 h a 37°C |
| Adaptado de la referencia: | Sato et al. 2011 | Bartfeld et al. 2015 | Broutier et al. 2016 | Hennig et al. 2019 |
| Medio de cultivo (Básico: Medio basal II) |
| A83-01 | 0,5 μM | 2 μM | 5 μM | 0.5 μM |
| B27 | 1 vez | 1 vez | 1 vez | 1x |
| B27 sin vitamina A | - | - | 1 vez | - |
| Forskolina | - | - | 10 μM | - |
| hFGF-10 | - | 200 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml |
| hHGF | - | - | 25 ng/ml | - |
| [Leu15] Gastrin | 10 nM | 1 nM | 10 nM | 10 nM |
| mEGF | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml |
| N2 | - | - | 1 vez | - | 1 vez |
| N-acetil-L-cisteína | 1,25 mM | 1 mM | 1 mM | 1 mM |
| Nicotinamida | 10 mM | 10 mM | 10 mM | 10 mM |
| Cabeza | 10 % | 10 % | - | 10 % |
| Primocina | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) |
| Prostaglandina E2 | 10 nM | - | - | - | 1 μM |
| Rspondin | 20 % | 10 % | 10 % | 10 % |
| SB202190 | 3 μM | - | - | - |
| Wnt3A | 50 % | 50 % | - | 50 % |
| *Tampón quelante: 5,6 mM Na2HPO4, 8,0 mM KH2PO4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM sacarosa, 54,9 mM d-sorbitol, 0,5 mM dl-ditiotreitol en agua destilada |
