1. Digestión de tumores pancreáticos
- Coloque el tumor pancreático disecado, los tumores metastásicos o el tejido pancreático sano en PBS helado y guárdelo en hielo.
- Use fórceps para transferir el tumor a una placa de Petri.
- Agregue 5.0 mL de medio de digestión (2 mg/mL de colagenasa, 0.025 mg/mL de DNasa RPMI) en un tubo de 50 mL; almacene en hielo para evitar que comience la actividad enzimática.
nota: Este protocolo utiliza colagenasa tipo V, que tiene una actividad de ≥1 unidades/mg de FALGPA y > 125 unidades de digestión de colágeno (CDU)/mg sólido. Las alícuotas de colagenasa y DNasa pueden almacenarse a -20 °C y descongelarse en hielo antes de su uso. Cuando ambos están completamente solubilizados en RPMI estéril, pueden pasar a través de un filtro de 0,2 μm para eliminar los contaminantes. La colagenasa debe estar completamente solubilizada antes de filtrar para evitar la pérdida de material.
- Tome una pequeña alícuota de esta solución para cubrir el tumor en la placa de Petri.
- Use un bisturí estéril y fórceps para cortar el tumor en pedazos pequeños, de aproximadamente menos de 3 mm de largo.
- Raspe los pedazos del tumor en el tubo e invierta suavemente el tubo hasta que todos los pedazos estén sumergidos en el medio de digestión. Almacene en hielo si es necesario preparar otras muestras de tumores en un lote.
- Transfiera a un dispositivo de agitación durante 20 minutos a 37 °C. Asegúrese de que todas las piezas del tumor estén sumergidas y no pegadas al borde del tubo. Si no es posible agitar, agite la muestra cada 5 minutos para ayudar a la digestión.
2. Preparación de suspensión unicelular a partir de tumor digerido
- Inmediatamente después del paso de digestión, coloque el tubo en hielo para disminuir la actividad enzimática.
- Agregue EDTA para lograr una concentración final de 20 mM y brevemente la muestra de vórtice para mezclar. Esto ralentizará aún más la actividad enzimática.
- Abra el tubo y enjuague cualquier digestión tumoral de la tapa del tubo con medio RPMI fresco.
- Prepare un colador de 70 μm (el tamaño de μm del colador se puede modificar según se desee) en un tubo abierto de 50 mL, sobre hielo.
- Humedezca previamente el filtro con medio.
- Vuelva a suspender las células digeridas y lave los lados del tubo con una tira de 25 ml o más grande. La abertura más ancha de la tira es importante para permitir que el digestión espesa pase fácilmente.
- Transfiera todo el digesto, usando la tira de 25 ml, al colador.
- Machaca el tumor en la parte superior del filtro con un émbolo de jeringa de 1 mL. Machaca solo directamente hacia arriba y hacia abajo para minimizar el esfuerzo cortante en las celdas.
- Lave continuamente las celdas a través del colador con RPMI. Asegúrese de lavar con suficiente fuerza para empujar las celdas.
- Si todavía hay material para triturar, pero el RPMI deja de fluir, el colador estará saturado. Por lo tanto, transfiera la muestra a un nuevo filtro y continúe.
nota: Eventualmente, solo los componentes de la matriz extracelular permanecerán en el filtro, todas las células individuales deberían haber pasado.
- Centrifugar el tubo durante 5 min a 300 x g y 4 °C.
- Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet de células en RPMI completo y páselo directamente a través de otro filtro para eliminar cualquier matriz extracelular o grupos de células grandes que no se puedan resuspender adecuadamente.
- En este punto, si no se requiere estimulación, tiñir inmediatamente las células aisladas para el análisis de citometría de flujo saltando a centrifugar la placa durante 5 min a 300 x g y 4 °C. Retire el sobrenadante moviendo la placa boca abajo con un movimiento brusco. Alternativamente, vuelva a suspenderlos en medio de congelación (10% de DMSO en FBS) y almacene a -80 °C, seguido de un almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido.
nota: La etapa de congelación puede permitir la purificación de las células inmunitarias en una fecha posterior; Sin embargo, la cuantificación de los subconjuntos de células inmunitarias puede requerir optimización para confirmar que el número de células y el fenotipo no se ven afectados por el proceso de congelación/descongelación. La estimulación ex vivo de las células T se realiza mejor en muestras tumorales frescas. En este punto, la muestra se puede purificar aún más mediante ensayos de eliminación de células muertas basados en perlas o de enriquecimiento de células inmunitarias, si es necesario.
3. Preparación de las células para la estimulación ex vivo
- Cuente las células para lograr una concentración de 2 x 106/ 100 μL en medio completo (RPMI 10 % FBS, 1X penicilina y 1X estreptomicina).
nota: El alto número de células totales plateadas garantiza que habrá suficientes células T dentro de esta muestra para analizar. Sin embargo, el número puede aumentarse o reducirse en función de la disponibilidad de muestras y de la naturaleza poco frecuente de los subconjuntos de células T de interés.
- Placa de 100 μL de células en una placa de 96 pocillos con fondo en U.
- Añadir 100 μL de medio completo que contenga una preparación 2x de PMA/ionomicina (para lograr una concentración final de 0,081 μM y 1,34 μM, respectivamente, según lo recomendado por el fabricante).
nota: Si mide la degranulación/exocitosis, incluya también aquí un anti-ratón CD107a conjugado con fluorescencia en el medio. También se debe realizar una muestra de control que no contenga CD107a.
- Colocar en incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 1 h.
- Añadir 20 μL de un preparado 10x de brefeldina A y monensina (para lograr una concentración final de 1,06 μM y 2,0 μM, respectivamente (según lo recomendado por el fabricante) en medios completos
nota: La brefeldina A y la monensina son inhibidores del transporte de proteínas y, por lo tanto, bloquean la liberación extracelular de citocinas, etc., lo que permite su detección por citometría de flujo. Si se mide la liberación de citocinas en el sobrenadante mediante ELISA o métodos similares, se puede omitir este paso.
- Coloque la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h más.
