Imágenes de la dinámica del calcio en las células pancreáticas: una técnica para estudiar los cambios en tiempo real en la concentración de calcio citosólico en los islotes pancreáticos

Resumen

Fuente: Hamilton, A., et. al. Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la técnica de obtener imágenes de las células de los islotes en tiempo real, para estudiar los cambios en la concentración de calcio citosólico en las subpoblaciones menores de las células de los islotes pancreáticos. Las subpoblaciones de células menores se pueden identificar utilizando respuestas funcionales a compuestos marcadores, como la adrenalina y la grelina, que inducen cambios en el calcio citosólico en poblaciones específicas de células de los islotes. Esto puede proporcionar una visión de la comunicación cruzada entre la glucosa en sangre y la salida secretora de los islotes.

Protocolo

1. Cargar el tinte o expresar el sensor

1. Prepara el tinte atrapable.
   1. Disuelva la alícuota (normalmente, 50 μg) del colorante atrapable (por ejemplo, Fluo-4) en DMSO hasta una concentración de stock de 2 mM. Añadir ácido plurónico hasta una concentración final del 1% (utilizando un 20% de caldo en DMSO), para mejorar la solubilización del colorante.
   2. Alicuente el colorante en pequeños tubos de PCR (2 μL en cada uno). El tinte se puede almacenar congelado (-20 °C) durante varias semanas.
2. Alternativamente, prepare el sensor recombinante.
   1. Distribuya el sensor (por ejemplo, vector adenoviral que codifica GCaMP6f) en alícuotas de 10 μL y guárdelo a -80 °C.
   2. (Opcionalmente) pre-pruebe el título de la reserva viral infectando islotes (como se muestra a continuación) utilizando varias diluciones seriadas, para revelar la concentración óptima para la infección.
      nota: Los sensores recombinantes codificados por diferentes vectores (lentivirus, BacMam, AAV) requieren un protocolo de infección diferente. Asegúrese de verificar esto con el proveedor de vectores y optimice la relación de trabajo para sus necesidades. El material de "trabajo" del adenovirus puede almacenarse a -20 °C y congelarse/descongelarse varias veces. El ciclo excesivo de congelación y descongelación reduce el título efectivo del virus.
3. Prepare la solución de diagnóstico por imágenes.
   1. Componen la solución de imagen, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7,4, con NaOH).
   2. Constituya una reserva de glucosa (0,5 M) y manitol (0,5 M) en la solución de imagen. El caldo se puede almacenar en la nevera (4 °C) durante varias semanas.
4. Carga el tinte atrapable.
   1. Prepare la solución de trabajo del colorante disolviendo 2 μL del colorante en 600 μL de la solución de imagen que contiene 6 mM de glucosa. La solución se puede calentar o vortexizar para mejorar la solubilización.
   2. Cargue los islotes aislados en la solución de trabajo del tinte. La carga se puede realizar utilizando una placa multipocillo o una placa de Petri. En este último caso, coloque una gota de 100 μL de la solución de trabajo en el fondo de una placa de Petri no adhesiva (35 o 60 mm) y pipetee 10-30 islotes en la gota.
   3. En el caso de diferentes grupos de islotes (por ejemplo, de tipo salvaje/knock-out), organice varios pozos y varias gotas para que la carga se pueda realizar simultáneamente.
   4. Incubar los islotes en la solución de trabajo de tinte a temperatura ambiente en la oscuridad durante 70-90 minutos. No incube en exceso.
   5. Verifique la carga bajo el microscopio de fluorescencia; los islotes deben obtener una fluorescencia leve, y algunas células son más brillantes que el resto. El redondeo de las células y la localización nuclear del tinte son signos de sobrecarga.
   6. Transfiera los islotes a una solución de imagen sin colorante que contenga 6 mM de glucosa. Los islotes se pueden usar para obtener imágenes de inmediato, pero opcionalmente se puede dejar que el tinte se desesterifique durante otros 10-15 minutos. Los islotes retendrán el tinte durante varias horas y, por lo tanto, se pueden usar para obtener imágenes en varios turnos.
5. Alternativamente, infecte los islotes con el vector recombinante.
   1. Colocar los islotes en gotitas en medio de cultivo RPMI (RMPI1640 (ver Tabla de Materiales), suplementado con 10% de suero fetal de ternero, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina. Dispense el medio en dos placas de Petri de plástico de 60 mm (no tratadas con ningún adhesivo) y mantenga las placas en la incubadora (37 °C, 5% de CO₂, humedad absoluta)). (por ejemplo, 30 μL), para minimizar el volumen de vector necesario.
   2. Agregue el vector en una proporción de aproximadamente 10⁵ unidades infecciosas por islote que idealmente debería resultar en una multiplicidad de infecciones >2. Idealmente, la relación debería optimizarse a la relación mínima que proporcionaría expresión en la capa periférica. La prevaloración (paso 1.2.2) puede ayudar.
   3. Introducir 20-50 islotes en la gotita y cultivar durante 8-48 horas. (Idealmente, durante la noche). Los islotes deben desarrollar una fluorescencia verde tenue en la mayoría de las células, sin cambios en la morfología celular.
      nota: El éxito de la infección y la expresión dependen del tiempo de exposición a la solución viral. Idealmente, el virus debe permanecer en la solución durante la noche, pero opcionalmente se puede eliminar después de tan solo 15 minutos. Sin embargo, es probable que la infectividad y, por lo tanto, la expresión, sea drásticamente menor.

2. Imagen de la dinámica de Ca²⁺

1. Inmovilizar los islotes bajo el microscopio (invertido).
   1. Ensamble la cámara de imágenes para microscopía invertida. Coloque el cubreobjetos de vidrio (espesor 1 o 1,5) dentro de la cámara y asegúrese de que la interfaz de la cámara de vidrio sea hermética. Compruebe que el cubreobjetos esté al alcance del objetivo del microscopio (crítico para el caso de un objetivo voluminoso de alta NA).
   2. Prepare los accesorios de inmovilización. Corta pequeños rectángulos (20 mm x 20 mm) de la malla fina y la malla gruesa. Introduzca dos "paredes" espaciadoras en la malla fina con una cinta adhesiva de 45-50 μm de grosor. Utilice capas dobles del espaciador si el tamaño de los islotes que se van a visualizar supera sustancialmente los 100 μm convencionales
   .
   3. Sumerja las mallas y el peso en la solución de imagen utilizando una placa de Petri de 35 mm. Asegúrate de que el plástico y el metal estén mojados.
   4. Bajo un microscopio de disección, voltee la malla fina con las "paredes" del espaciador al revés, con los espaciadores hacia arriba. Elija varios islotes cargados con el colorante atrapable o que extraiga el sensor recombinante con una pipeta P20 y colóquelos suavemente encima de la malla fina, entre los dos espaciadores. Asegúrese de que la malla y las arandelas no contengan cantidades excesivas de la solución de imagen.
   5. Levante la malla con los islotes, utilizando pinzas de relojero, y colóquela boca abajo dentro de la cámara de imagen, de modo que los espaciadores miren hacia abajo y se asienten directamente sobre el cubreobjetos de la cámara. Asegúrese de que los islotes queden atrapados entre los espaciadores y la malla, en el centro del cubreobjetos.
   6. Coloque la malla gruesa y el peso encima de la malla fina dentro de la cámara. Introduzca la solución de imagen en la cámara. Asegúrese de que los islotes estén inmovilizados y listos para ser fotografiados. Evite agitar excesivamente la cámara (son aceptables pequeñas perturbaciones como llevar la cámara al microscopio e insertarla en una etapa calentada).
      nota: Se puede aplicar una disposición de inmovilización similar para un sistema vertical.
2. Configura el microscopio.
   1. Elija el modo de imagen y el objetivo, coloque la cámara con los islotes del paso 2.1 en la platina de temperatura controlada del microscopio.
      1. Ajuste el control de temperatura (idealmente, entre 30 °C y 36 °C) y la perfusión. Para un sistema invertido, coloque el flujo de entrada más bajo que el flujo de salida dentro de la cámara y configure el flujo de salida para que sea mayor que el del flujo de entrada (lo que generalmente se logra mediante el uso de un tubo de un diámetro interno más amplio en una bomba peristáltica).
      2. Asegúrese de que el flujo de salida tenga una superficie de contacto mínima con la solución, de modo que elimine la solución en múltiples gotas pequeñas secuenciales, evitando largos intervalos de eliminación continua de la solución. Esta última es la principal fuente de artefactos en las imágenes de lapso de tiempo de las señales periódicas, ya que aparecen como oscilaciones periódicas regulares de intensidad de cada píxel fotografiado y con frecuencia se interpretan como "ondas lentas".
      3. Inicie la perfusión con la solución de imagen que contiene 3 mM de glucosa.
   2. Elija la trayectoria de la luz y los filtros para obtener imágenes de los fluoróforos verdes; la excitación entre 470 y 500 y la emisión entre 505 y 550 funcionarían para cada uno de ellos.
   3. Ejecute imágenes en vivo para configurar los parámetros de imagen. Ajuste la vista para capturar los islotes de interés.
   4. Optimice la relación señal-ruido de la imagen. Para ello, ajuste la excitación, la intensidad de la luz, el tiempo de exposición y el agrupamiento. Asegúrese de que la configuración permita una visualización distinta de cada celda dentro del islote con la mínima intensidad de luz y exposición posibles.
   5. Realizar la adquisición de imágenes. Dependiendo de la tarea, las imágenes se pueden tomar a 0,1 a 5 Hz. Esto está muy por debajo de los criterios de Nyquist para las oscilaciones rápidas impulsadas por Na⁺ en celdas de α y δ (>300 Hz), lo que significa que los datos están submuestreados de forma predeterminada. Sin embargo, aumentar la frecuencia de adquisición para satisfacer esta demanda no es factible en la obtención de imágenes multicelulares/multiislotes con un gran campo de visión. GCaMP se puede obtener más rápido, mientras que Fluo4 se blanqueará inevitablemente en condiciones de adquisición rápida
      nota: Dado que las oscilaciones de [Ca²⁺] _cyt en las células de los islotes son impulsadas por la actividad eléctrica, el uso de tasas de adquisición bajas puede parecer contraproducente. En realidad, sin embargo, las tasas de adquisición alrededor o por encima de 1 Hz pueden ser suficientes para resolver el comportamiento de aumento de β células, mientras que el umbral para la detección de oscilaciones impulsadas por el canal de sodio en las células de α y δ está muy por encima de 300 Hz. Ya sea que las oscilaciones de la α o de la δ célula [Ca²⁺] _se adquieran a 1 Hz o 0,1 Hz, se submuestrearán gravemente y reflejarán el manejo de Ca²⁺ por parte de la célula en lugar de la actividad eléctrica.
      1. Comprobar la calidad de los datos adquiridos: a 3 mM de glucosa, la actividad de las células α debe ser claramente visible/detectable. Asegúrese de que este sea el caso y proceda a la obtención de imágenes de lapso de tiempo a escala real.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Objetivo 40x/1.3
GCaMP6f, en vector adenoviral (tipo humano 5)	Biolabs Vector	Año 1910
Suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
RPMI medio	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
penicilina/estreptomicina	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Microscopio Axiovert 200
Fluo4	Thermo Fisher (Life Technologies)	F14201