Aislamiento primario de células acinares: un método para aislar células acinares del páncreas de ratón

Resumen

Fuente: Fleming Martinez, A. K., et al. Imitación y manipulación de la metaplasia pancreática acinar-ductal en cultivo celular tridimensional. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la técnica utilizada para aislar las células acinares pancreáticas--células exocrinas-- que contienen una variedad de enzimas digestivas. Las células acinares primarias son útiles en el estudio ex vivo de la metaplasia acinar-ductal (ADM), un evento temprano en el desarrollo del cáncer de páncreas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de Jove.

1. Aislamiento de células acinares

1. Sacrificar al ratón mediante inducción de CO ₂ y realizar la luxación cervical. Disecciona inmediatamente el páncreas. Para diseccionar el páncreas, primero fije las patas del ratón a la tapa de poliestireno, oriente al ratón de manera que la cola quede frente al investigador y rocíe el abdomen con etanol al 70%
   nota: El ratón utilizado en los resultados representativos fue una hembra no transgénica de 12 semanas de edad con fondo C57BL/6. La selección del mouse se discute con más detalle en la sección de discusión.
   1. Usando un juego de tijeras y pinzas esterilizadas en autoclave, levante el pelaje/piel con las pinzas en la línea media y use las tijeras para hacer una incisión a través del pelaje y la piel desde la abertura uretral hasta el área del diafragma/caja torácica.
   2. Haga incisiones adicionales a la izquierda y a la derecha de modo que se corte el pelaje o la piel para crear una vista clara de la cavidad abdominal. Luego, corte el revestimiento peritoneal (por el medio y hacia la derecha y la izquierda) y retírelo de los órganos, como se hizo con el pelaje / piel.
   3. Levante los intestinos con las pinzas y colóquelo en el lado izquierdo del ratón creando espacio para ver el páncreas, que es de color rosa claro, y unido al bazo, que es un óvalo rojo oscuro. El tejido pancreático se distingue por su textura suave y esponjosa. Corta el páncreas, que correrá a lo largo del estómago y se entrelazará con los intestinos.
   4. Separa el bazo del páncreas. A continuación, coloque el páncreas en un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de HBSS con 1x penicilina-estreptomicina y llévelo a la campana de flujo laminar.
      nota: Los pasos restantes del protocolo deben realizarse utilizando la técnica estéril en una campana de flujo laminar.
2. Vierta el páncreas y el HBSS (con penicilina-estreptomicina) en un recipiente de pesaje vacío y, con pinzas, lave el páncreas agitándolo. Luego, mueva el páncreas con las pinzas a un segundo recipiente de pesaje que contenga HBSS (con penicilina-estreptomicina). Nuevamente, lave el páncreas revolviéndolo.
3. Mueva el páncreas al tercer recipiente de pesaje que contiene HBSS (con penicilina-estreptomicina) y comience a cortar el páncreas en pedazos pequeños de 5 mm o menos. A continuación, vierta los trozos de páncreas y el HBSS en un tubo vacío de 50 ml.
   1. Para hacer esto, use las pinzas para mover las piezas del páncreas en el líquido a medida que se inclina el bote de pesaje. Vierta una vez que todas las piezas ya no estén unidas al bote de pesaje. Recoja los pedazos restantes con las pinzas y lave las pinzas en el tubo de 50 ml que contiene el páncreas en HBSS con penicilina-estreptomicina.
4. Centrifugar a 931 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, eliminar el HBSS (y cualquier grasa que esté flotando) pipeteándolo con una pipeta de 5 mL.
5. Agregue 5 mL de colagenasa (Prepare 40 mL de HBSS + 5% FBS, 20 mL de HBSS + 30% FBS y 5 mL de 2 mg/mL de colagenasa en HBSS. Esterilizar la colagenasa por filtración (poro de 0,22 μm) y mantener a temperatura ambiente. Mantenga cada una de las soluciones de HBSS en hielo) al páncreas. Asegúrese de que la tapa esté sellada envolviendo el tubo de 50 ml en una película plástica de parafina y luego colóquelo en una incubadora agitando a 220 rpm durante 20 minutos a 37 °C.
   nota: El tiempo de digestión de la colagenasa puede variar, como se señaló en la discusión. Al final de la incubación, no deben quedar grandes trozos de tejido.
6. Para detener la disociación, coloque el tubo que contiene páncreas en hielo y agregue 5 mL de HBSS frío + 5% de FBS. Centrifugar a 931 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, pipetear el sobrenadante con una pipeta de 5 mL.
7. Vuelva a suspender en 10 mL de HBSS + 5% de FBS y centrifugue a 931 x g durante 2 min a 4 °C. Pipetear el sobrenadante con una pipeta de 5 mL y repetir este paso con otros 10 mL de HBSS + 5% de FBS
.
8. Vuelva a suspender en 5 mL de HBSS + 5% de FBS y, usando un P1000, transfiera 1 mL a la vez a través de una malla de 500 μm a un tubo de 50 mL. Agregue 5 ml adicionales de HBSS + 5% de FBS a través de la malla con un P1000 para lavar las células pancreáticas restantes a través de la malla.
9. Coloque la suspensión celular de la malla de 500 μm a través de la malla de 105 μm pipeteando 1 ml a la vez con un P1000. A continuación, pipetee suavemente la suspensión celular en un tubo que contenga HBSS + 30% FBS. Se formará una capa de suspensión celular en la parte superior; Tras la centrifugación, las células acinares se hundirán para formar un pellet.
10. Centrifugar a 233 x g durante 2 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1x medio completo de Waymouth.
    1. Si se procede directamente a la incrustación de células en el colágeno o en la matriz de la membrana basal, resuspender en un volumen de 7 mL por páncreas. Si se procede a una infección adenoviral o lentiviral, resuspender en 4 mL por páncreas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora vibratoria a 37 °C	Termo Científico	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubadora	NUAIRE	NU-5500
Tubos de 50 ml	halcón	352070
Almohadilla absorbente, 20" x 24"	Marca Pescadora	1420662
Aguja deslizante de precisión BD 21G x 1/2	Fisher Científico	305167	Uso como alfileres para la disección
Vaso de precipitados, 600 mL	Marca Pescadora	FB-101-600
centrífuga	Beckman Coulter	Centrífuga Allegra X-15R
Colagenasa tipo I, Clostridium histolyticum	sigma	C0130-1G	Cree una solución de 100 mg/ml disolviendo el polvo en agua estéril de grado de biología molecular. Al descongelar una alícuota, diluir a 10 mg/ml, esterilizar con filtro y colocar alícuotas de 1 ml a -20 °C.
dexametasona	sigma	D1756	Cree una solución de 4 mg/ml disolviendo el polvo en metanol, alícuota y almacenándolo a -20 °C.
Etanol, 200 grados	Laboratorios Decon	Artículo 2701
Suero Fetal Bovino	sigma	F0926-100mL
fórceps	Herramientas de Bellas Ciencias	11002-12
fórceps	Herramientas de Bellas Ciencias	91127-12
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS), sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol	Fisher Científico	SH3048801
Cubitera, rectangular	Fisher Científico	07-210-103
Bolsas de muestras LAB GUARD (para ratones después de la disección)	Minigrip	SBL2X69S
Parafilm	Bemis	PM992	Denominada "película plástica de parafina" en el manuscrito
Pbs	Fisher Científico	SH30028.02
Penicilina-Estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Puntas de pipeta, 10 μl	Científico de EE. UU	1110-3700
Puntas de pipeta, 1000 μl	Plásticos Olympus	24-165RL
Puntas de pipeta, 200 μl	Científico de EE. UU	1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipetas, 10 ml	halcón	357551
Pipetas, 25 ml	halcón	357525
Pipetas, 5 ml	halcón	357543
Malla de polipropileno, 105 μm	Laboratorios de espectro	146436
Malla de polipropileno, 500 μm	Laboratorios de espectro	146418
tijeras	Herramientas de Bellas Ciencias	14568-12
tijeras	Herramientas de Bellas Ciencias	14568-13
Bicarbonato de sodio (polvo blanco fino)	Fisher Científico	BP328-500
hidróxido sódico	Fisher Científico	S318-500
Inhibidor de la tripsina de la soja	Gibco	17075029
espátula	Marca Pescadora	21-401-10
Steriflip 50 ml, filtros de 0,22 micras	Millipore	SCGP00525
Colágeno de cola de rata tipo I	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medio (polvo)	sigma	W1625-10X1L
Bote de pesaje, hexagonal, medio	Marca Pescadora	02-202-101