Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de materiales, soluciones y bases matriciales tridimensionales
- Corte mallas de polipropileno de 500 μm y 105 μm en cuadrados de 76 mm por 76 mm. Dobla cada cuadrado por la mitad dos veces para crear un cuadrado doblado más pequeño. Coloque un cuadrado de malla de 500 μm y otro de 105 μm en una bolsa esterilizable en autoclave.
- Cuadrados de malla de polipropileno para autoclave, así como dos pares de tijeras y pinzas.
- Prepara 100 ml de 10x solución de Waymouth. Mezcle 1 vial (14 g) de polvo de Waymouth en 50 ml de agua desionizada (DI) y, cuando se disuelva, agregue 30 ml de bicarbonato de sodio al 7,5% (75 g/L). Lleve el volumen final a 100 ml con agua desionizada y filtro esterilizante.
- Almacene 10 veces los medios de Waymouth a 4 °C y utilícelos para preparar geles de colágeno y 1 vez los medios de Waymouth. Cuando se formen precipitados, deséchelos.
- Prepare 50 ml de 1 x Waymouth complete media per pancreas agregando 125 μL de 40 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja, 12,5 μL de 4 mg/ml de dexametasona y 500 μL de suero fetal bovino (FBS). Esterilizar por filtración y utilizar en 48 h.
- Prepare bases de matriz tridimensionales utilizando colágeno o matriz de membrana basal (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el producto). Al pipetear la base, coloque la placa sobre hielo, evite las burbujas y gírela inmediatamente después de pipetear el volumen de cada pocillo para garantizar una cobertura completa.
- Cree bases de colágeno mezclando los siguientes componentes con hielo en una campana de cultivo de tejidos: 5,5 mL de colágeno de cola de rata tipo I, 550 μL de 10x Waymouth's Media y 366,6 μL de NaOH 0,34 M (filtrado).
NOTA: Esta es una solución suficiente para hacer bases de colágeno para una placa de 24 pocillos, 12 pocillos o 6 pocillos. Una placa es suficiente para el aislamiento acinar de un páncreas.
- Utilice los siguientes volúmenes para colocar la base de colágeno: 80 μL (portaobjetos de vidrio de 8 pocillos), 200 μL (placa de 24 pocillos), 400 μL (placa de 12 pocillos) u 800 μL (placa de 6 pocillos).
- Para las bases de la matriz de la membrana basal, pipete la matriz sin ningún componente adicional. Utilice los siguientes volúmenes para cada pocillo: 50 μL (portaobjetos de vidrio de 8 pocillos), 120 μL (placa de 24 pocillos), 240 μL (placa de 12 pocillos) o 600 μL (placa de 6 pocillos).
- Deje que las bases se solidifiquen durante al menos 30 minutos en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO2) antes de crear una segunda capa de matriz con células incrustadas encima de estas bases.
- En preparación para el aislamiento acinar, mantenga un vaso de precipitados de 600 ml, tres tubos de 50 ml, un par de tijeras esterilizadas en autoclave, un par de pinzas en autoclave y un cubo de hielo debajo del capó con tres botes de pesaje. A continuación, prepare 30 ml de HBSS con 300 μl de penicilina-estreptomicina 100x, colocando 10 ml en cada uno de los dos recipientes de pesaje y guardando los últimos 10 ml en un tubo de 50 ml (para usar en los pasos 1.8.2 y 2.1.4).
- Produzca 40 mL de HBSS + 5% de FBS, 20 mL de HBSS + 30% de FBS y 5 mL de colagenasa de 2 mg/mL en HBSS. Esterilizar la colagenasa por filtración (poro de 0,22 μm) y mantener a temperatura ambiente. Mantenga cada una de las soluciones HBSS en hielo.
- Prepare un espacio de trabajo para la disección del páncreas, que se puede hacer en una mesa de laboratorio.
- Coloque una almohadilla absorbente sobre la mesa, junto con una tapa de poliestireno cubierta con papel de aluminio. Luego coloque una toalla de papel con 4 alfileres encima del papel de aluminio.
- Mantenga los siguientes artículos al alcance del espacio de trabajo de disección: una bolsa de incineración, un juego de tijeras y pinzas esterilizadas en autoclave, una botella de spray con etanol al 70% y una cubeta de hielo (con el tubo de 50 ml de HBSS que contiene penicilina-estreptomicina del paso 1.6).
- Ajuste una centrífuga a 4 °C y un agitador a 37 °C.
2. Aislamiento de células acinares
- Sacrificar al ratón mediante inducción de CO2 y realizar la luxación cervical. Disecciona inmediatamente el páncreas. Para diseccionar el páncreas, primero fije las patas del ratón a la tapa de poliestireno, oriente al ratón de manera que la cola quede hacia el investigador y rocíe el abdomen con etanol > El ratón utilizado en los resultados representativos fue una hembra no transgénica de 12 semanas de edad con fondo C57BL/6. La selección del mouse se discute con más detalle en la sección de discusión.
- Usando un juego de tijeras y pinzas esterilizadas en autoclave, levante el pelaje/piel con las pinzas en la línea media y use las tijeras para hacer una incisión a través del pelaje y la piel desde la abertura uretral hasta el área del diafragma/caja torácica.
- Haga incisiones adicionales a la izquierda y a la derecha de modo que se corte el pelaje o la piel para crear una vista clara de la cavidad abdominal. Luego, corte el revestimiento peritoneal (por el medio y hacia la derecha y la izquierda) y retírelo de los órganos, como se hizo con el pelaje / piel.
- Levante los intestinos con las pinzas y colóquelo en el lado izquierdo del ratón creando espacio para ver el páncreas, que es de color rosa claro, y unido al bazo, que es un óvalo rojo oscuro. El tejido pancreático se distingue por su textura suave y esponjosa. Corta el páncreas, que correrá a lo largo del estómago y se entrelazará con los intestinos.
- Separa el bazo del páncreas. A continuación, coloque el páncreas en un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de HBSS con 1x penicilina-estreptomicina y llévelo a la campana de flujo laminar.
nota: Los pasos restantes del protocolo deben realizarse utilizando la técnica estéril en una campana de flujo laminar.
- Vierta el páncreas y el HBSS (con penicilina-estreptomicina) en un recipiente de pesaje vacío y, con pinzas, lave el páncreas agitándolo. Luego, mueva el páncreas con las pinzas a un segundo recipiente de pesaje que contenga HBSS (con penicilina-estreptomicina). Nuevamente, lave el páncreas revolviéndolo.
- Mueva el páncreas al tercer recipiente de pesaje que contiene HBSS (con penicilina-estreptomicina) y comience a cortar el páncreas en pedazos pequeños de 5 mm o menos. A continuación, vierta los trozos de páncreas y el HBSS en un tubo vacío de 50 ml.
- Para hacer esto, use las pinzas para mover las piezas del páncreas en el líquido a medida que se inclina el bote de pesaje. Vierta una vez que todas las piezas ya no estén unidas al bote de pesaje. Recoja los pedazos restantes con las pinzas y lave las pinzas en el tubo de 50 ml que contiene el páncreas en HBSS con penicilina-estreptomicina.
- Centrifugar a 931 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, eliminar el HBSS (y cualquier grasa que esté flotando) pipeteándolo con una pipeta de 5 mL.
- Añadir 5 mL de colagenasa (diluida en HBSS en el paso 1.7) al páncreas. Asegúrese de que la tapa esté sellada envolviendo el tubo de 50 ml en una película plástica de parafina y luego colóquelo en una incubadora agitando a 220 rpm durante 20 minutos a 37 °C.
NOTA: El tiempo de digestión de la colagenasa puede variar, como se señaló en la discusión. Al final de la incubación, no deben quedar grandes trozos de tejido.
- Para detener la disociación, coloque el tubo que contiene páncreas en hielo y agregue 5 mL de HBSS frío + 5% de FBS. Centrifugar a 931 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, pipetear el sobrenadante con una pipeta de 5 mL.
- Vuelva a suspender en 10 mL de HBSS + 5% de FBS y centrifugue a 931 x g durante 2 min a 4 °C. Pipetear el sobrenadante con una pipeta de 5 mL y repetir este paso con otros 10 mL de HBSS + 5% de FBS
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- Vuelva a suspender en 5 mL de HBSS + 5% de FBS y, usando un P1000, transfiera 1 mL a la vez a través de una malla de 500 μm a un tubo de 50 mL. Agregue 5 ml adicionales de HBSS + 5% de FBS a través de la malla con un P1000 para lavar las células pancreáticas restantes a través de la malla.
- Coloque la suspensión celular de la malla de 500 μm a través de la malla de 105 μm pipeteando 1 ml a la vez con un P1000. A continuación, pipetee suavemente la suspensión celular en un tubo que contenga HBSS + 30% FBS. Se formará una capa de suspensión celular en la parte superior; Tras la centrifugación, las células acinares se hundirán para formar un pellet.
- Centrifugar a 233 x g durante 2 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1x medio completo de Waymouth.
- Si se procede directamente a la incrustación de células en el colágeno o en la matriz de la membrana basal, resuspender en un volumen de 7 mL por páncreas. Si se procede a una infección adenoviral o lentiviral, resuspender en 4 mL por páncreas.
3. Infección viral
- Dado que un páncreas es suficiente para dos infecciones virales (control y experimental, por ejemplo, nula y cre), divida la suspensión celular entre las tapas de dos placas de 35 mm. El uso de la tapa de las placas permite la infección en suspensión y, por lo tanto, un fácil movimiento hacia el sustrato final más tarde.
- Cuando trabaje con virus, remoje todas las puntas de pipeta usadas en lejía al 10% durante al menos 15 minutos.
nota: La utilización de las placas de 35 mm y el volumen de 4 mL funciona bien para células de ratones no transgénicos de entre 8 y 16 semanas de edad. Es posible que sea necesario ajustar el tamaño y el volumen de la placa para animales con páncreas más pequeños o más grandes.
- En el caso de la infección adenoviral, agregue el virus (con un título de al menos 107 TU/mL) en una dilución de 1:1,000 a la tapa de cada placa y gire (Figura 1, adenovirus GFP). Coloque las placas en una incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% CO2) y revuelva cada 15 minutos durante 1 h. Continúe la incubación durante 2 h adicionales y luego proceda a la incrustación de las células en la matriz de colágeno o membrana basal.
- Después de completar el trabajo viral en el capó, remoje todos los componentes del capó con lejía al 10% durante al menos 15 minutos y luego limpie a fondo la lejía con etanol al 70%.
4. Incrustación de células en la matriz de colágeno o membrana basal
- Haga gel de colágeno en hielo combinando 7 ml de colágeno de cola de rata tipo I (3,3 mg/mL), 700 μL de medios 10x Waymouth y 466,6 μL de NaOH 0,34 M.
- Tomando volúmenes iguales de gel de colágeno y suspensión celular, mezcle suavemente. Si agrega un estímulo o inhibidor, combínelo con la suspensión de células de colágeno. Placa de un pocillo a la vez (placas del paso 1.5.3); Manteniendo el plato en hielo, gírelo para distribuir uniformemente la capa de células de colágeno.
- En cada pocillo, pipete los siguientes volúmenes de suspensión de células de colágeno: 200 μL (portaobjetos de vidrio de 8 pocillos), 500 μL (placa de 24 pocillos), 1000 μL (placa de 12 pocillos) o 2000 μL (placa de 6 pocillos). Obsérvese que la ADM se induce a través de la estimulación con TGF-α (50 ng/mL) en la Figura 1.
- Para la inclusión de células en la matriz de la membrana basal, mezcle la matriz de la membrana basal de una parte con la suspensión celular de dos partes. Al igual que con el colágeno, mantenga la suspensión de células de la matriz, así como la placa, en hielo. Pipetear un pocillo a la vez utilizando los mismos volúmenes indicados en 4.2.1 y girar para una distribución uniforme.
- Coloque la placa en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO2) durante 30 min para que se solidifique y luego agregue 1x el medio completo de Waymouth con cualquier estímulo o inhibidor (la Figura 1 usa TGF-α a 50 ng/mL). Cambie el medio (con estímulo o inhibidor) al día siguiente y luego cada dos días. Dependiendo del estímulo, la ADM se puede observar entre el día 3 y el día 5.
