Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
Las herramientas quirúrgicas necesarias se muestran en la Figura 1 y el diagrama esquemático del procedimiento se muestra en la Figura 2.
1. Soluciones
- Prepare la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) agregando 100 mL de HBSS 10X (de stock) a 900 mL de agua destilada para hacer 1 L de HBSS (1X).
- Prepare la solución STOP (debe hacerse fresca y debe usarse dentro de 1 h) agregando 50 mL de suero fetal bovino (FBS) 100X a 450 mL de HBSS 1X helado; esto hace 500 mL de solución STOP. Mantenga la solución STOP a 4 °C.
- Prepare la solución de colagenasa P (debe hacerse fresca dentro de 1 h después de ser utilizada) agregando 1 mg/mL de colagenasa P a 1X HBSS helado; use 6 mL/ratón.
- Añadir 0,05% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) a la solución de colagenasa P (esto proporciona nutrientes a los islotes aislados). Por ejemplo, use 3 mg de BSA en una solución de 6 mL de colagenasa P.
- Calcule y prepare la cantidad de colagenasa P necesaria para todos los ratones en un tubo de 50 ml.
- Prepare el medio RPMI 1640 completo añadiendo 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, suplemento celular INS-1 (10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0,05 mM de 2-mercaptoetanol) a 500 mL de medio RPMI 1640 que contiene 5,5 mM de glucosa para ser utilizado para el cultivo nocturno y la incubación.
2. Preparación
- Llene tres tubos de 50 mL de 25 mL de solución inhibidora de ARNasa, etanol al 70% o H2O destilado. Estas soluciones se utilizarán para limpiar las herramientas quirúrgicas antes y durante el procedimiento.
- Remoje las puntas de las herramientas en una solución inhibidora de ARNasa durante 30 minutos antes de iniciar el protocolo; esto elimina cualquier posible RNasa en las herramientas.
- Almohadillas absorbentes precortadas de 6 pulgadas x 6 pulgadas para usar durante la cirugía.
- Prepare 1X solución de HBSS con anticipación y guárdela a 4 °C. Prepare la solución STOP antes de la cirugía. Conservar a 4 °C.
- Prepare la solución de colagenasa P inmediatamente antes de la cirugía y guárdela en hielo.
nota: Esto debe usarse dentro de las 2 horas posteriores a la preparación.
- Etiquete los tubos de 50 ml para la digestión y la purificación; prepare 2 tubos para cada ratón, uno para la digestión y el otro para la purificación de los islotes. Asegúrese de que la identificación del animal esté en ambos tubos.
- Agregue 3 mL de solución de colagenasa P en el primer tubo de 50 mL. Se inyectarán los 3 mL restantes de colagenasa P.
- Extraiga los 3 mL restantes de solución de colagenasa en una jeringa de 3 mL montada con aguja de 30 G 1/2. Coloque la jeringa sobre hielo.
3. Procedimiento
- Retire todas las herramientas de la solución inhibidora de ARNasa, luego sumérjalas primero en el tubo con etanol al 70%, luego en el tubo que contiene H2O destilado, luego seque al aire sobre una toalla de papel limpia.
- Coloque el ratón en una cámara que contenga 0,5 mL de isoflurano hasta que el ratón esté profundamente anestesiado.
- Retire el ratón de la cámara y compruebe el estado de la anestesia pellizcando una almohadilla para los pies con pinzas. La anestesia profunda se basa en la observación de que la respiración se vuelve constantemente lenta y el ratón no reacciona al pellizco de los pies. Después de confirmar que el ratón está profundamente anestesiado, eutanasiar al ratón con dislocación cervical y luego colocar el ratón en la almohadilla absorbente.
- Coloque al ratón anestesiado boca abajo, aplicando presión en el cuello y dislocando la columna vertebral del cerebro tirando de la cola.
- Tape las extremidades del ratón en posición supina a la almohadilla absorbente, rocíe el cuerpo con etanol al 70% y limpie el exceso de etanol.
- Use pinzas para cubrir vidrios y tijeras quirúrgicas curvas para hacer incisiones. Primero haga una incisión horizontal en la piel del área abdominal (~ 3 cm), abra la piel para exponer la pared abdominal. A continuación, realice una incisión vertical (~3-4 cm) en el peritoneo abdominal para exponer completamente el páncreas en la cavidad abdominal (Figura 3).
- Empuje los lóbulos del hígado hacia arriba para exponer el conducto biliar, aparecerá como un tubo de color rosa pálido (Figura 3).
- Mover cuidadosamente los intestinos desde la región lumbar/ilíaca derecha de la cavidad abdominal hacia la derecha, exponiendo el conducto biliar y la arteria hepática (Figura 3).
- Pinzar cuidadosamente el conducto biliar común con el micro serrefines de Schwartz (Figura 1) lo más cerca posible del hígado.
- Identificar la ampolla de Vater, que se localiza en la papila duodenal, formada por la unión del conducto pancreático y el conducto biliar común. La ampolla de Vater parece hinchada cuando se observa bajo un microscopio de disección, que es el punto de entrada al conducto biliar común (Figura 4).
nota: El ajuste de la intensidad/ángulo de la luz del microscopio de disección puede facilitar su localización.
- Inserte la jeringa con 3 mL de la solución de colagenasa P en la ampolla de Vater. Introduzca la aguja en el conducto aproximadamente 1/4 de la longitud del conducto biliar común (la ampolla conduce al conducto) como se muestra en la figura 5.
- Una vez que la aguja esté en la ampolla, asegúrese de que la orientación de la aguja sea tal que quede paralela al conducto.
- Estabilice la aguja sujetándola con micropinzas de Adson para evitar que perfore el conducto (Figura 5).
- Inyecte lenta y constantemente 3 mL de la solución de colagenasa P de la jeringa en el conducto biliar común (lo suficiente como para sentir resistencia) como se muestra en la Figura 6. El objetivo es crear una presión de reflujo para obligar a la colagenasa a entrar en el conducto pancreático. La inyección se considera exitosa si la cabeza, el cuello, el cuerpo y la región de la cola del páncreas están completamente inflados><.
nota: La producción de islotes será baja si el páncreas no está completamente inflado o si el área esplénica no está completamente inflada. El área esplénica contiene el mayor número de islotes6. La inflación puede confirmarse por la aparición de espacios abiertos entre el tejido pancreático que se llenan de solución.
- Diseccione cuidadosamente el páncreas inflado y colóquelo en un tubo de digestión de 50 mL que contenga 3 mL de solución de colagenasa P helada.
- Retire el páncreas con 2 pinzas (curvas y Micro Adson; Ver Figura 1): (comenzando desde el bazo, separe el páncreas del bazo y continúe retirándolo desde el estómago y a lo largo del duodeno.
nota: No requiere incisiones.
- Picar el páncreas durante 3-5 s en el tubo de digestión con 3 mL de solución helada de colagenasa P utilizando unas tijeras quirúrgicas finas (Figura 7A).
- Fije el tubo a una rejilla en un baño de agua a 37 °C y agite a 100-120 rpm durante aproximadamente 12-13 min.
- Después de la incubación, agite suavemente los tubos con la mano para romper el tejido hasta que la solución de digestión de colagenasa P se vuelva homogénea (Figura 7B). La homogeneidad se confirma por una apariencia arenosa de partículas finas de páncreas. Unos 30 segundos de suave apretón de manos suelen ser suficientes. Sostenga el tubo a la luz para examinar si el tejido está bien homogeneizado; Agite durante otros ~ 15 s si es necesario.
- Una vez digeridos, coloque inmediatamente los tubos en hielo y agregue 40 mL de solución STOP helada para terminar la digestión enzimática.
nota: En este punto, los tubos de digestión se pueden dejar en hielo hasta 2 h, si se trabaja con varios ratones.
- Centrifugar el tubo en una centrífuga de cubo oscilante a 300 x g durante 30 s (la temperatura de la centrífuga es flexible)
nota: Utilice una centrífuga de cubo oscilante para que la pastilla de tejido se forme en la parte inferior del tubo de 50 ml y no en la pared del tubo; Esto es fundamental para un mejor rendimiento de los islotes.
- Decantar y repetir la centrifugación con la solución STOP 2 veces más, decantando la solución después de cada centrifugado. Utilice 20 ml de solución STOP para cada lavado posterior.
- Antes de cada centrifugado, rompa el pellet agitando suavemente el pellet de tejido en el tubo de 50 mL en solución STOP de 20 mL.
- Vuelva a suspender el pellet de papel tisú con 40 ml de HBSS helado y centrifugue a 300 x g durante 30 s.
- Decantar y repetir la centrifugación utilizando una centrífuga de cubo oscilante con solución de HBSS dos veces más, decantando la solución después de cada centrifugado. Use 20 ml de HBSS para cada lavado.
- Antes de cada centrifugado, rompa el pellet para separarlo del fondo del tubo agitando suavemente el tubo que contiene 20 ml de solución de HBSS.
- Después de la última centrifugación, retire todos los HBSS.
- A continuación, añada 5 mL de gradiente de densidad a temperatura ambiente al tubo de 50 mL que contiene el pellet. Vórtice brevemente a baja velocidad hasta que se homogeneiza.
- Añada otros 5 mL del gradiente de densidad a temperatura ambiente al tubo de 50 mL.
nota: Es fundamental permanecer constante y quieto para permitir que se forme un mejor gradiente sin interrupciones.
- Pipetear 10 mL de tampón HBSS a temperatura ambiente en el tubo (que contiene el gradiente de densidad), gota a gota suave y lentamente para permitir que se forme un gradiente. Utilice una pistola de pipetas con una pipeta de 10 ml para añadir HBSS gota a gota.
- Usando una centrífuga de cubo oscilante, haga girar los tubos a 1700 x g durante 15 min. Asegúrese de cambiar la velocidad de ambas aceleraciones/desaceleraciones al ajuste más bajo para mantener el gradiente (Figura 7C).
- Después del centrifugado, retire con cuidado los tubos sin alterar el gradiente. Utilizando una pistola de pipetas prehumedecida con HBSS frío (pipeta HBSS hacia arriba y hacia abajo), pipetee la capa de islotes (5-10 mL) formada entre el gradiente de densidad y el HBSS en el nuevo tubo de recolección de islotes de 50 mL.
nota: Es útil humedecer la pipeta con HBSS frío antes de pipetear los islotes para evitar que estos se peguen a las paredes internas de la pipeta.
- En caso de que la separación sea incompleta, los islotes serían visibles en la capa de gradiente de densidad, pipetear los 10 mL completos del gradiente de densidad (capa inferior) junto con la capa de islotes formada en la interfaz (solo para dejar atrás unos 8-10 mL de la capa superior de HBSS)
nota: La recolección de la capa de islotes y la capa de gradiente de densidad (capa inferior) puede resultar en la recolección de escombros que pueden alargar el tiempo de recolección de islotes, pero no se alterarán otros pasos. No es necesario recolectar ambas capas cuando la capa de islotes está bien formada.
- Agregue 20 mL de HBSS helado al nuevo tubo de 50 mL que contiene los islotes, luego centrifugue a 350 x g durante 3 min en una centrífuga de cubo oscilante.
- Después del centrifugado, pipetee con cuidado (no decante) el sobrenadante (deje ~ 3 mL en el fondo) sin alterar el gránulo que contiene los islotes en la parte inferior. Deseche el sobrenadante.
- Repita el lavado y centrifugado al menos 3 veces. Agregue 20 ml de HBSS cada vez y asegúrese de suspender la bolita antes de cada centrifugado.
- Caliente el frasco de medios completos RPMI-1640 en un baño de agua a 37 °C antes de usarlo. Después de la última centrifugación, retire todo el HBSS y agregue 4 mL de medio RPMI-1640 completo previamente preparado (que contiene FBS, suplemento celular INS-1 y penicilina/estreptomicina) al pellet.
- Desaloje el pellet girando suavemente el tubo e inmediatamente vierta el medio RPMI-1640 en una placa de Petri de 100 mm. Agregue otros 5 mL de medio RPMI-1640 al tubo y gírelo suavemente para lavar los islotes restantes, luego también vierta el medio en la misma placa de Petri.
- Bajo un microscopio de disección, recoja los islotes sanos de la placa de Petri con una pipeta de 20 μL y colóquelos en una nueva placa de Petri que contenga 10 mL de medio RPMI 1640 completo. Cuando se observan bajo un microscopio de disección, los islotes deben aparecer esféricos/oblongos y de color marrón dorado con una superficie lisa en comparación con el tejido exocrino relativamente transparente >y tenue<.
nota: El aumento del microscopio de disección suele ser de 12,5 a 16x. El rendimiento de los islotes variará dependiendo de varios factores, como la cepa, la edad y el sexo del ratón. Este protocolo suele producir entre 250 y 350 islotes sanos de ratones C57BL/6J sanos de 4 a 10 meses de edad.
- Incubar los islotes en una incubadora estéril a 37 °C con una infusión de CO2 al 5% y aire humidificado al 95% durante la noche para realizar experimentos al día siguiente, o congelar los islotes para el análisis deseado en un momento posterior.
- Una vez que los islotes se congelan, no se pueden utilizar para ensayos de secreción, solo para la cuantificación de ARN o proteínas. Para recoger las células para congelarlas, colóquelas en tampón HBSS, recoja todos los islotes en 200-500 μL de tampón, transfiéralo a un tubo de 1,5 mL, centrifugue 350 x g durante 1-2 min, retire el sobrenadante dejando no más de 30-40 μL de solución, colóquelo a -20 °C para almacenamiento a corto plazo (varios días) o -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
