Tinción inmunofluorescente de esferoides: una técnica para analizar la expresión de esferoides para la expresión de antígenos intra y extracelulares

Resumen

Fuente: Cavaco, A. C. M. et al. Un modelo de esferoide 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación e invasión de fibroblastos asociados al cáncer en estudios in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la técnica de tinción inmunofluorescente de esferoides para comprender la diferenciación de los fibroblastos o CAFs. Este protocolo ayuda a detectar la expresión de antígenos intracelulares y extracelulares, incluido el depósito de proteínas ECM dentro de los esferoides.

Protocolo

1. Tinción inmunofluorescente de esferoides

1. Recoja los esferoides después de aproximadamente 24 h en un tubo de reacción de 1,5 mL por condición experimental o por proteína a analizar. Por ejemplo, colocar los esferoides de las iNFs estimuladas con TGF-β1 en un tubo diferente a las iNFs de control, que no fueron tratadas. Para evitar la ruptura de los esferoides debido a fuerzas de cizallamiento demasiado fuertes, corte el extremo de la punta de la pipeta para agrandar el orificio. Incluya al menos 5-10 esferoides en un tubo de reacción, para permitir réplicas y tener en cuenta las posibles pérdidas durante las etapas de lavado.
2. Centrifugar los esferoides con una centrífuga de sobremesa durante unos 30-60 s a 1.000 x g. Retire con cuidado el sobrenadante que contiene metilcelulosa mediante pipeteo, sin alterar los esferoides granulados.
3. Lavar con 50 μL de 1x PBS. Repita el paso de centrifugación y retire con cuidado el PBS mediante pipeteo, como se describe en 1.2.
4. Dependiendo de la proteína a teñir, fijar con 50 μL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (para αSMA, NG2 e integrina α3β1) o con 50 μL de metanol durante 10 min a -20 °C (para las subunidades de laminina-332).
5. Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 1.2-1.3.
6. Permeabilizar las células con Triton-X al 0,1% en PBS durante 4 min a temperatura ambiente.
7. Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 1.2-1.3 tres veces.
8. Incubar los esferoides en PBS que contengan 5% de FBS y 2% de BSA, durante 1 h en RT para bloquear los sitios de interacción de proteínas no específicos.
9. Incubar los esferoides con 30 μL de anticuerpos primarios en PBS, 2,5% de FBS y 1% de BSA a 4 °C durante la noche. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-αSMA Cy-3 conjugado y anti-NG2 a 5 μg/mL; BM2 anti-laminina α3, 6F12 anti-laminina β3 y anti-laminina γ2 20 μg/mL.
10. Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 1.2-1.3 tres veces.
11. Incubar los esferoides con 30 μL de anticuerpos secundarios en PBS, 2,5% de FBS y 1% de BSA en RT durante 90 min. Los siguientes anticuerpos secundarios utilizados fueron: Alexa 488 anti-conejo y anti-ratón (5 μg/mL).
12. Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 1.2-1.3 tres veces.
13. Incubar las células con 30 μL de solución de tinción DAPI durante 4 min a temperatura ambiente.
14. Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 1.2-1.3.
15. Coloque los esferoides en un portaobjetos de vidrio, en una gota de PBS, usando una pipeta Pasteur de vidrio.
16. Obtenga imágenes de los esferoides mediante microscopía de fluorescencia en un microscopio de barrido láser utilizando un aumento de 10x. Tome diferentes secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes planos ópticos de una pila z (15-20 planos de pila). Para establecer la configuración del láser en el microscopio, utilice un esferoide compuesto por células negativas para el antígeno de interés o un esferoide teñido solo con el anticuerpo secundario. Vuelva a utilizar la misma configuración para todas las muestras que se compararán.
17. Analice las imágenes microscópicas con el software ImageJ como se publicó anteriormente. Los pasos se resumen en la Figura 1. Como antecedente, determine la densidad de señal integrada de una región de interés (ROI) libre de celdas. Calcule la fluorescencia celular corregida total (TCCF) como:
    TCCF = densidad de señal integrada - (área del esferoide seleccionado x fluorescencia media del fondo)
18. Determine la fluorescencia total corregida (TCF) de los esferoides a medida que el TCCF normalizado al área del esferoide y el número de pilas.
    TCF = TCCF de esferoide / (área de esferoides x número de pilas)

Resultados

Figura 1. Pasos secuenciales para la cuantificación de la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en esferoides, utilizando ImageJ. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	D9542-10
6F12 anti-Laminina β3 subunidad Ratón (monoclonal)			casero
Fracción V de Albúmina - BSA	AppliChem	A1391
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) anti-Ratón	Invitrogen	A11029
Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) Conejo	Invitrogen	A11034
Anti-laminina γ2 subunidad Ratón (monoclonal)	Santa Cruz	SC-28330
Centrífuga de banco	Fisher Científico	50-589-620	retoño
BM2 anti-laminina α3 subunidad Ratón (monoclonal)			Amablemente proporcionado por la Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Tubos de centrífuga 50 mL	Corning	430290
Microscopio confocal	Zeiss
DMEM (glucosa alta 4,5 g/L)	Lonza	BE12-604F
Fibroblastos pancreáticos primarios humanos	PELOBiotech	PB-H-6201
Penicilina/estreptomicina	Gibco	Números 15140-122
Portaobjetos de microscopio	Termo Científico	J1800AMNZ
Paraformaldehido	Riedel-de Haën	Año 16005
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS